引用本文
阚利娜, 顾逸敏, 赵卫国, 何俊民. β-人绒毛膜促性腺激素光激化学发光免疫分析方法的建立[J].检验医学, 2015,25(10): 779-783
KAN Lina, GU Yimin, ZHAO Weiguo, HE Junmin. Development of light initiated chemiluminescent immunoassay for beta-human chorionic gonadotrophin[J]. Labratory Medicine, 2015,25(10): 779-783  
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《检验医学》编辑部
β-人绒毛膜促性腺激素光激化学发光免疫分析方法的建立
阚利娜1, 顾逸敏2, 赵卫国3, 何俊民1
1. 同济大学生命科学与技术学院,上海 200092
2. 上海市徐汇区中心医院心内科,上海 200031
3. 博阳生物科技(上海)有限公司,上海 201210

作者简介:阚利娜,女,1979年生,学士,主要从事医学诊断试剂研究工作。

通讯作者:赵卫国,联系电话:021-50791287。

摘要
目的 建立一种检测人血清β-人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)浓度的光激化学发光免疫分析方法。方法 采用2株针对不同抗原表位的抗β-HCG抗体,其中一株抗体用来包被发光微粒,另一株抗体标记生物素,以双抗体夹心法检测人血清中的β-HCG浓度,并与Beckman-Coulter公司试剂(化学发光法)进行比较。结果 发光微粒浓度为100 μg/mL、生物素标记抗体浓度为7 μg/mL时,检测范围为0~1 000 mIU/mL,灵敏度为0.16 mIU/mL,平均回收率为100.3%,批内变异系数( CV)为0.80%~3.99%,批间 CV为2.25%,与TSH、FSH和LH的交叉反应率低,稳定性较好,与化学发光法的符合率好( r=0.99)。结论 光激化学发光免疫分析方法测定β-HCG具有较高灵敏度、精密度和准确性,与化学发光法的符合率较好,适用于临床测定。
关键词: β-人绒毛膜促性腺激素; 光激化学发光免疫分析方法; 微粒
中图分类号:Q579.1 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2010)10-0779-05
Development of light initiated chemiluminescent immunoassay for beta-human chorionic gonadotrophin
KAN Lina1, GU Yimin2, ZHAO Weiguo3, HE Junmin1
1. School of Life Sciences and Technology,Tongji University, Shanghai 200092, China
2. Department of Cardiology, Xuhui District Central Hospital, Shanghai 200031, China
3. Beyond Diagnostic Inc., Shanghai 201210, China
Abstract
Objective To develop a light initiated chemiluminescent immunoassay for human beta-human chorionic gonadotrophin(β-HCG).Methods Two monoclonal antibodies with different epitopes to β-HCG were selected. One was coated on luminescent microspheres, and the other was biotinylated. The β-HCG concentration in human sera was determined by double antibody sandwich light initiated chemiluminescent immunoassay, and the results were compared with Beckman-Coulter reagent (chemiluminescent immunoassay).Results The detection range of the assay was 0-1 000 mIU/mL, when the concentrations of the luminescent microspheres and the biotinylated antibody were 100 μg/mL and 7 μg/mL respectively. The sensitivity was 0.16 mIU/mL, and the recovery rate was 100.3%. The within-run and between- run coefficients of variation( CV) were 0.80%-3.99% and 2.25% respectively. The cross reaction rates of the assay with thyrotropic-stimulating hormone(TSH), follicle-stimulating hormone(FSH) and luteotropic hormone(LH) were low. The stability of the detection method was good. The coincidence rate with the chemiluminescent immunoassay was highly significant( r=0.99).Conclusions The light initiated chemiluminescent immunoassay for human β-HCG have good sensitivity, precision and accuracy. The coincidence rate with Beckman kits is good, and this assay can be applied for clinical determination.
Keyword: Beta-human chorionic gonadotropin; Light initiated chemiluminescent immunoassay; Microsphere

人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, HCG)是糖蛋白激素家族成员之一。该家族成员还包括LH、FSH、TSH, 都是由一个α 亚基和一个β 亚基组成的异二聚体。其中α 亚基含有92个氨基酸, 为糖蛋白激素家族成员所共有; β 亚基决定了各成员的生物学活性, 并在各成员间显示了广泛的同源性。在HCG和LH的β 亚基之间, 二者的同源性为80%。HCG的β 亚基含有145个氨基酸, LH的β 亚基含有121个氨基酸, 二者的不同在于C末端的24个氨基酸。HCG的相对分子质量为37 500, 其中α 亚基的相对分子质量为14 000, β 亚基的相对分子质量为23 500 [1]。

目前, 在临床诊断中建立快速、灵敏的HCG测定方法是人们关注的焦点。已经报道的方法有放射免疫分析[2]、电化学免疫分析[3]、时间分辨免疫荧光分析[4]等, 但这些方法具有核辐射危害、敏感性差、可定量测定范围窄、需要反复清洗与分离、检测耗时长、自动化程度不高等缺点。我们开发了β -HCG的光激化学发光免疫分析方法(light initiated chemiluminescent assay, LICA), 通过引入激光技术与纳米微粒技术, 成功地解决了上述不足。反应在均相进行, 既加快了反应速度, 又避免了反复分离与清洗步骤, 能有效降低检测背景值, 减少反应时间, 并可实现自动化操作。

材料和方法
一、主要材料

人β -HCG单克隆抗体(1号和3号)由博阳生物科技(上海)有限公司抗原抗体组提供。发光微粒由博阳生物科技(上海)有限公司微粒组(ATG)提供。LICA通用液系LICA HT光激化学发光检测仪的配套试剂。TSH、FSH和LH购自中国药品生物制品检定所。生物素购自Sigma-Aldrich公司。精制马血清购自上海普龙生物技术研发有限公司。二奎啉甲酸(BCATM)法蛋白质定量检测试剂盒购自Thermo Fisher Scientific公司。患者样本80份, 为中国福利会国际和平妇幼保健院提供的β -HCG定值血清。96孔微孔板为LICA HT高通量均相发光免疫分析仪配套专用板。

二、主要仪器

LICA HT高通量均相发光免疫分析仪、LICA SP全自动移液器由上海博阳医疗仪器有限公司提供; 粒径仪为岛津SALD-7101激光衍射式粒度分布测量仪。

三、实验方法

1. 免疫发光微粒的制备 取适量发光微粒, 微粒表面带有活性醛基基团, 粒径约为150 nm, 经离心处理, 超声分散至0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH值7.0)中, 以10∶ 4(W/W)的比例加入1号β -HCG单克隆抗体, 加入上述反应液体积的1%的40 mg/mL三氢硼氰化钠(NaCNBH3)催化, 37 ℃旋转混合反应48 h, 进行离心, 清洗未反应的单抗, 之后将其定容至100 μ g/mL, 4 ℃保存备用[5]。

2. β -HCG抗体的标记 取3号β -HCG单克隆抗体, 将其溶液的pH值调整为8.5, 以1∶ 30(摩尔比)的比例加入生物素(Biotin), 4 ℃混合反应过夜, 之后将未反应的生物素进行透析处理, 将其定容至7 μ g/mL, 4 ℃保存备用。

3. 标准品的制备 将一份经Beckman-coulter Access[化学发光法(CLIA)]系统定值的β -HCG患者混合样本用马血清系列稀释, 配制成0、5、25、150、500、1 000 mIU/mL的β -HCG标准液, 然后再使用Beckman-Coulter Access(CLIA)系统对每个稀释液进行标定, 标定合格后, 分装成每管1 mL, 在离心管上标注批号、名称、浓度、体积、制备人和日期等信息, 并将其保存在-20 ℃备用。

4. 检测原理 在均相条件下将内部带有染料的LICA通用液微粒以及包被有活性分子并且内部带有发光化合物的发光微粒混合物和检测样本混合。此时LICA通用液微粒和包被有活性分子的发光微粒可迅速有效地捕捉靶分子并形成免疫夹心复合物。外部激发光照射后, LICA通用液微粒中的染料被诱导激活, 并释放高能态的单线态。该高能态的活性氧被近距离的发光微粒俘获, 传递能量以激活所述发光微粒中的发光化合物。数微秒后, 发光微粒中的发光化合物将释放出高能级红光。用光子计数器测定这些高能级光子, 得到相对光量子单位(RLU)值。

5. 检测方法 在96孔微孔板中, 每孔依次加入标准品或者待测样本25 μ L、100 μ g/mL 免疫发光微粒试剂25 μ L、7 μ g/mL生物素标记试剂25 μ L, 将微孔板置于LICA HT光激化学发光检测仪内, 仪器程序设定为37 ℃温育1 200 s, 然后仪器自动加入LICA通用液175 μ L, 37 ℃温育900 s, 读取光信号RLU值。

四、检测方法性能评价

1. 灵敏度 重复测定20孔0 mIU/mL标准品, 计算这20孔的RLU均值( x̅)和标准差(s), 以 x̅+2s反代入标准曲线, 得到的浓度值即为分析灵敏度, 采用不同批次的试剂和标准品进行3次该实验, 求得的 x̅即为本检测方法的灵敏度。

2. 回收率 取一份已知浓度(β -HCG浓度为15.4 mIU/mL)的患者血清, 分成等体积的3份, 分别等体积加入浓度为8.2、350.0和896.0 mIU/mL的β -HCG样本并测定其浓度, 与其理论浓度进行比较, 计算每份回收率。回收率=[(实测值-基质值)/理论值]× 100%。

3. 精密度 用正常人血清制成高、中、低质控血清, 期望浓度分别为820、390和14 mIU/mL, 测定该质控血清浓度, 将高、中、低质控血清各平行做10孔, 计算批内变异系数(CV), 连续测定3 d, 计算批间CV[6]。

4. 特异性 将LH、FSH和TSH溶解于马血清中, 配制成5 000 mIU/mL(LH)、3 000 mIU/mL(FSH)和6 000 μ IU/mL(TSH)的储备液。各取50 μ L储备液加入950 μ L马血清, 分别制备成250 mIU/mL(LH)、150 mIU/mL(FSH)和300 μ IU/mL(TSH)的测试样本。对照样本为马血清。测定这3个测试样本和对照样本的RLU值, 将RLU值反代入标准曲线, 得到的浓度即为这3种交叉反应物质的交叉反应量。

5. 稳定性 为观察温度与环境对试剂稳定性的影响, 将试剂分别在4 ℃存放3个月, 37 ℃存放7 d, 然后对其进行物理检查, 并在线性、灵敏度、精密度方面考察其稳定性。

6. 与Beckman-Coulter公司试剂相关性比较 取80份β -HCG患者血清样本, 分别用建立的LICA和Beckman-Coulter公司试剂(化学发光法)进行检测, 并对2种方法的检测值进行比较, 得到相关性曲线。

结 果
一、免疫发光微粒的定容

将经过彻底清洗的免疫发光微粒用发光试剂缓冲液定容至10 mg/mL, 取样在粒径仪上测定微粒粒径, 测得的粒径结果为152 nm(CV=8.3%)。

二、标记抗体的定容

将透析好的标记抗体吸出转移至干净离心管中, 取样以BCA法测定抗体浓度。

三、 标准品的标定及线性

将制备得到的标准品用Beckman-Coulter Access(CLIA)系统进行标定, 各个浓度的测定值与理论值见于表1。配制的β -HCG标准品经过Beckman-Coulter Access(CLIA)系统标定后, 得到的实测浓度和理论浓度的比值在0.9~1.1之间, 符合要求。将标准品浓度和RLU值分别取以10为底的对数, 然后以标准品浓度的对数为横坐标, 以RLU值的对数为纵坐标, 对标准品的浓度和RLU值进行双对数直线回归拟合, r=0.997。表明该检测方法的线性较好, 得到的曲线见图1。

表1 自制标准品标定结果

图1 标准品的浓度和信号值的双对数直线回归图

四、灵敏度

采用建立的LICA测定灵敏度。用3个批次的试剂和标准品进行试验, 得到的灵敏度分别为0.16、0.15、0.17 mIU/mL, x̅为0.16 mIU/mL, s为0.01, 3个批次试剂的CV为7.56%。

五、回收率

3份加入不同浓度β -HCG样本的测定结果分别为12、176和469 mIU /mL, 回收率分别为101.7%、96.3%和102.9%, 平均为100.3%。

六、精密度

测得的精密度见表2、表3。高、中和低值质控血清的批内CV为0.80%~3.99%, 平均为1.90%。批间CV分别为 0.72%、4.03% 和2.00%, 平均为2.25%。

表2 批内精密度测试结果
表3 批间精密度测试结果
七、特异性

250 mIU/mL LH、150 mIU/mL FSH和300 μ IU/mL TSH可以产生的交叉反应量分别为3.1、2.4和0.8 mIU/mL, 均< 5.0 mIU/mL, 这三者对β -HCG的检测干扰较小, 见表4。

表4 LH、FSH和TSH的交叉反应量
八、稳定性研究

将在4 ℃存放3个月、37 ℃存放7 d的试剂取出, 对其进行物理检查, 并在线性、灵敏度、精密度方面考察其稳定性, 结果见表5。

表5 稳定性研究结果
九、与化学发光法检测结果的相关性

分别用LICA法和化学发光法检测80份患者血清样本β -HCG浓度, 结果显示2种检测方法具有较好的相关性。相关性曲线见图2, 相关性方程为Y=1.051 3X-0.568, r=0.996, 符合斜率在0.9~1.1之间、截距< 1.0、r值> 0.99的要求。

图2 LICA与化学发光法的相关性曲线

讨 论

本研究采用LICA, 用Biotin标记和双抗体夹心法, 建立起测定β -HCG的方法, 并对其进行了多项指标的考核。结果表明, LICA的本底低、灵敏度高、特异性强、准确性和重复性好、分析时间短(仅为45 min)。在4 ℃存放3个月、37 ℃存放7 d的试剂外观目测没有变化, 在线性、灵敏度、精密度方面也和新制备的试剂没有明显差异, 所以该试剂的稳定性佳。LICA的分析灵敏度为0.16 mIU/mL, 低于市场上同类产品的灵敏度(0.5 mIU/mL), 从而使得本方法的适应性更广, 也可以给HCG的快速诊断方法学建立提供参考[7]。本法的回收率高, 在90%~110%之间; 质控血清的批内和批间CV均< 5%, 具有很好的准确性和重复性。实验中采用的单抗针对的是HCG的β 亚基。所以, 本法的交叉反应率低, 特异性强。本法与化学发光法的相关性较好, 得到的相关性曲线的斜率接近于1, 截距< 1, r值为0.996。

在人体内, 妇女妊娠时HCG水平会大幅升高[8], HCG在受孕后6~8 d 产生, 在妊娠的前8周增长很快, 以维持妊娠, 50~80 d 达到高峰, 以后逐渐下降, 直到孕20周达相对稳定。一般来讲, 多胎妊娠的血清HCG水平要高于单胎妊娠[9]。妊娠异常时, 如唐氏综合征妊娠、葡萄胎妊娠 [10], 母体血清的HCG水平同样异常于正常妊娠, 本法同样适用于该类异常妊娠的诊断。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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