碳青霉烯酶是指能够明显水解亚胺培南或美罗培南的一类β-内酰胺酶,包括Ambler 分子分类为A、B、D 3类酶^{[ 2, 3]}。A 类为丝氨酸酶,其活性部位具有丝氨酸结构,属于Bush 分群中的第2f亚组。 A 类碳青霉烯酶少见,包括阴沟肠杆菌(IMI-1和NMC-A)、黏质沙雷菌中由染色体介导的NMC-A、Sme-1、Sme-2、Sme-3 、IMI-1 酶,以及肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌中质粒介导的KPC-1、GES-2酶^{[ 4]}。这类酶都是青霉素酶,他们对亚胺培南的水解活性强于美罗培南,可以引起青霉素类、氨曲南、碳青霉烯类耐药,而对第3代头孢菌素通常敏感。三唑巴坦、克拉维酸可以抑制此类酶,但不被乙二胺四乙酸(EDTA)所抑制。

Amble分类D 类为丝氨酸酶,属于Bush 分群中的第2d 亚组,其活性部位具有丝氨酸结构,由blaOXA等位基因编码,仅见于不动杆菌。

Amble分类B类是金属酶,属于Bush分类3组,是一种需金属离子发挥活性的β-内酰胺酶,由blaIMP、blaVIM、blaSPM和blaGIM编码,可被EDTA所抑制^{[ 2]},染色体介导或质粒介导,存在于多种不同革兰阳性和革兰阴性细菌中。金属酶均可明显水解亚胺培南,能水解除单环类抗菌药物以外的绝大多数β-内酰胺类抗菌药物,但对于其他β-内酰胺类抗菌药物的水解能力有较大差异^{[ 5]}。临床使用亚胺培南等碳青霉烯类抗菌药物大大增加, 导致金属β-内酰胺酶产生率有不断上升的趋势。目前尚未开发出有效的金属酶抑制剂。

细菌对碳青酶烯类抗菌药物耐药除了产水解碳青霉烯类β-内酰胺酶外, 耐药机制还可能涉及如下几个方面:(1)高产AmpC酶伴膜孔蛋白Omp缺失,如阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、弗劳地柠檬酸杆菌、大肠埃希菌及肺炎克雷伯菌。革兰阴性菌的细胞壁外膜的蛋白通道是药物进入细菌的重要途径,膜孔蛋白对β-内酰胺类抗菌药物的导入作用有其特异性,当某种膜孔蛋白表达减少或缺失时,相应的抗菌药物就不能进入细菌发挥作用;(2)青霉素结合蛋白改变。β-内酰胺类抗菌药物通过膜孔蛋白进入周质间隙,然后与青霉素结合蛋白结合而发挥抗菌作用,此蛋白发生结构变化, β-内酰胺类抗菌药物与之亲和力下降或不与其结合,则不能有效干扰细菌细胞壁的合成而产生耐药;(3)主动外排系统的活跃。细菌细胞内膜存在能量依赖性蛋白外排泵,通过主动外排作用将药物从菌体排出,使达到作用靶位的药量明显减少,不足以发挥杀菌或抑菌作用^{[ 6, 7]}。

1.KPC-1酶 2001年有学者在美国北卡罗来纳州肺炎克雷伯菌中发现由质粒介导的KPC-1酶^{[ 8]}。耐药表型表现出高度亚胺培南和美罗培南耐药性[最低抑菌浓度(MIC)均为16 μg/mL],当存在克拉维酸时,针对亚胺培南和美罗培南的β-内酰胺酶活性被抑制;对头孢菌素类抗菌药物和氨曲南也耐药。KPC-1基因由大约50 kb 的非结合性质粒携带。基因测序显示,核苷酸序列不同于基因库中已有的编码β-内酰胺类酶的基因。氨基酸序列分析显示, KPC-1 与来源于黏质沙雷菌S6的可水解碳青霉烯的β-内酰胺酶Sme-1有45% 的同源性, 其他3 种A 类碳青霉烯酶(Nmc-A、IMI-1、Sem-1) 间在核酸水平上相互的相似性> 90% , 说明KPC-1酶可能具有与这3种密切相关的A 类碳青霉烯酶不同的起源^{[ 8]}。外膜蛋白分析表明, 尽管存在OmpK36, 但未检测出OmpK35 和OmpK37的表达^{[ 8]}。总之,KPC-1酶是一种新的属于A 类Bush 2f组的可水解碳青霉烯的β-内酰胺酶, 肺炎克雷伯菌1534 的碳青霉烯耐药性主要由KPC-1酶介导, 孔蛋白表达的改变可能也起了某种作用。

2.KPC-2酶 2002年报道,1998年在马里兰州一名4岁腹泻患儿粪便里分离出一株沙门菌(AM04707),出现了耐大多数β-内酰胺类抗菌药物和亚胺培南的表型,检测出KPC-2酶^{[ 9]}。2003年,国际癌症研究协会(ICARE)项目报道了在1998年纽约州医院发现一株产酸克雷伯菌(产酸克3127)产KPC-2酶^{[ 10]}。

KPC-2酶与KPC-1酶有一个氨基酸的改变,S174G,分类也属于A类Bush 2f组。一个氨基酸的改变没有引起酶水解活性的改变。KPC-2酶是由863个核苷酸编码的157个氨基酸残基的肽链, 能引起碳青霉烯类耐药,不依赖于膜孔蛋白的丢失。外膜蛋白检测到OmpK36、OmpK35。KPC-2酶位于结合质粒的转座子上,具有高传播可能,与KPC-1酶不同的是,携KPC-2的质粒可水平传播给其他细菌。KPC-2酶从肠炎沙门菌和肺炎克雷伯菌而来,DNA序列表明,编码KPC-2的质粒与沙门菌中的质粒有98%的同源性,因此,此质粒可在肠杆菌中结合而传播KPC-2。以色列在4株大肠埃希菌中检测到了KPC-2基因^{[ 11]},并成功接合到易感菌株上,接合子对亚胺培南的MIC有显著增加,并未达到耐药水平,猜想供体菌很可能还有其他耐药机制,但KPC酶仍是主要耐药的原因。KPC-1酶与KPC-2酶另一个区别是, KPC-1酶对亚胺培南和美罗培南表达耐药,而携KPC-2酶的菌株常常对亚胺培南、美罗培南敏感或中介。Smith Moland等^{[ 12]}在一株肺炎克雷伯菌中发现KPC酶的同时,表型试验检测到菌株超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)阳性,产ESBLs为临床检测KPC-2酶带来一定困难。

基因结构分析显示,KPC-1酶和KPC-2酶可能来源相同,但KPC-1的编码质粒可以转移而KPC-2的编码质粒不能转移。由此推断KPC不同型的来源可能是相同的转移片段插入到了不同的质粒而引起。KPC-2酶能单独引起碳青霉烯类耐药,不依赖于膜孔蛋白的丢失,基因由可转移的70 kb质粒编码,位于质粒的转座子上,具有高传播可能。

3.KPC-3酶 2000年4月至2001年4月,纽约TISCH医院的重症监护病房有24例患者被感染了碳青霉烯类耐药的肺炎克雷伯菌,这是首次报道的亚胺培南耐药的肺炎克雷伯菌引起的感染^{[ 13]}。凝胶脉冲场电泳(PFGE)证实了此次医院感染由3个不同的克隆株引起,分别为CL5761、CL5762、CL5763。聚合酶链反应(PCR)扩增发现了一种新的KPC酶——KPC-3酶。药敏结果显示,对亚胺培南、美罗培南、头孢他啶、哌拉西林-三唑巴坦、庆大霉素敏感性降低,但对四环素敏感。KPC-3由75 kb的质粒编码,可以结合转移。PCR检测显示,3种携带KPC酶的细菌都含有ompK35、ompK36、ompK37的编码基因,膜蛋白电泳发现缺乏OmpK35,但有OmpK36,由此可能减少了细菌细胞壁的通透性,增强其耐药能力^{[ 13]}

KPC-3基因由75 kb的质粒携带,质粒可以传播给其他菌株。KPC-3酶是由882 bp的碱基编码的293个氨基酸残基的肽链,和KPC-1酶相比有2个碱基的改变,即Ser174gly和His272Tyr。 可通过电穿孔转移和结合。结合实验发现,所有的KPC结合子对碳青霉烯类的药敏比原菌株要敏感。 KPC-1、KPC-3酶均需要结合膜孔蛋白ompK35,其表达缺失引起对碳青霉烯类的耐药。

Anderson等^{[ 14]}研究表明,在检测KPC酶介导的耐药性时,厄他培南比单独的美罗培南、亚安培南敏感性更强。除了微量肉汤稀释法(BMD),美罗培南、亚胺培南的敏感性均比厄他培南低很多。但每种实验方法厄他培南的特异性都不及前两者。 厄他培南是检测KPC基因的最佳底物,临床上可以将其列为常规药敏试验。对所具有ESBLs/AmpC酶样表型(即对第3、第4代头孢菌素耐药)的肠杆菌科细菌采用纸片法或E-test法进行厄他培南(或其他碳青霉烯酶)的测定。2008年美国临床实验室标准化研究所(CLIS)关于产碳青霉烯酶的判断标准为:厄他培南MIC≤2 μg/mL,美罗培南、亚安培南MIC≤2 μg/mL,如MIC为2 μg/mL,4 μg/mL视作产KPC酶或其他碳青霉烯酶的可能。可以用改良的Hodge试验来评价检测KPC酶介导的耐药性方法,证实是否是因为产碳青霉烯酶而对碳青霉烯类耐药,其敏感性和特异性都为100%^{[ 14]}。

产KPC酶的亚胺培南耐药菌株中, blaKPC基因所在的质粒大多同时编码blaTEM-1基因,有的编码更多的基因,有的质粒则不能接合。 blaKPC基因通过某种机制在不同类型的质粒之间传播,携有blaKPC基因的质粒再通过水平传播使其他菌种或菌株获得耐药性。与接合前相比(亚胺培南MIC≤0.125 μg/mL) ,接合到KPC-2酶的大肠埃希菌对亚胺培南的敏感性明显降低(MIC 为2 μg/mL) ,但是仍处于敏感的水平(<4 μg/mL) ,提示一般的药物敏感试验难以检测到KPC-2 酶。国外学者也认为,产KPC酶的细菌对亚胺培南往往仅表现中介或敏感性的降低,并具有接种效应,导致KPC酶容易漏检或误检为其他类型的β-内酰胺酶^{[ 12]}。

根据2008年CLSI要求,实验室可以在药敏检测中增加厄他培南,对MIC 在2~4 μg/mL的菌株检测KPC基因。

KPC酶仅几年时间,已在美国,特别在美国东北部各州蔓延,在局部造成暴发和流行,而且在肠杆菌的多个菌属中都有报道,包括肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、大肠埃希菌、产酸克雷伯菌、沙门菌,主要为质粒介导。但阴沟肠杆菌中可由染色体介导,已成为临床治疗的难题。

自2001年在美国北卡罗来纳州肺炎克雷伯菌中发现由质粒介导的碳青霉烯酶KPC-1到2004年纽约州质粒介导的KPC-3肺炎克雷伯菌引起的医院感染, 美国以外检测到的碳青霉烯酶很少。2004至2006年在以色列的Tel Aviv医学中心检测到的耐碳青霉烯类的肺炎克雷伯菌急剧上升^{[ 11, 15]}。60% 的菌株只对庆大霉素、黏菌素敏感并携带有KPC-3 基因,其他菌株大多携带有KPC-2基因。2005年以后,产KPC酶的肺炎克雷伯菌在法国^{[ 16]}、南美^{[ 17]}、中国均有报道。

KPC酶大部分发现于美国,最近包括中国在内多个国家均有检出,说明该酶的传播已不再是一个地区性问题。值得注意的是,许多医院在检测出KPC基因时表示,患者没有到过已经有KPC的国家,由此推测KPC基因的出现是碳青霉烯类抗菌药物广泛应用引起的耐药基因突变。在相同医院不同病区患者检出KPC基因,而且部分患者无用亚胺培南史,这也不排除院内感染的可能。

2004年浙江大学医学院附属第一医院首次在临床分离到了产KPC-2酶的肺炎克雷伯菌^{[ 18]}。2006年浙江大学医学院附属第二医院首次在临床分离的多重耐药的弗劳地枸橼酸杆菌中检测到KPC-2酶^{[ 19]},说明KPC酶已经从克雷伯菌向肠杆菌属细菌、大肠埃希菌和枸橼酸杆菌等其他肠杆菌科细菌传播。2007年浙江大学医学院附属第二医院临床检验中心首次在黏质沙雷菌中发现KPC-2酶,该酶是引起黏质沙雷菌对亚胺培南耐药的主要原因^{[ 20, 21]}。

目前所报道的KPC酶分为1~4型,其中KPC-1位于一个非接合性质粒上,KPC-2、3都位于接合性质粒上。对目前所报道的相关文献进行统计和分类发现,世界各地与中国地区均以KPC-2型报道较多。对分离自几个不同地区的KPC-2基因结构进行研究表明,KPC-2位于一个新型的10 kb的转座子Tn4401上。该转座子的结构包括2个39 bp的重复序列、KPC-2结构基因、编码转座酶基因、2个新型的插入序列Iskpn6和Iskpn7。Iskpn6位于KPC-2结构基因的下游,属于ISS家族,Iskpn7位于KPC-2结构基因的上游,属于IS21家族。转座子Tn4401有5 bp的靶位复制序列,可以插入不同质粒的开放读码框(ORF)中,其可能是KPC基因质粒进一步转入到不同大小质粒的基础^{[ 22]}。

随着抗菌药物特别是第3代头孢菌素的广泛使用,产ESBLs的细菌不断增加,其耐药水平也越来越高。亚胺培南被认为是为数不多的可有效治疗高产AmpC酶和ESBLs的多重耐药菌株引起的严重感染的药物之一,亚胺培南耐药菌株的不断出现给临床治疗带来了困难。尤其是耐药基因位于可接合质粒上,通过水平传播使其他细菌获得耐药性,有引起严重医院感染的潜在危险。

目前产KPC 酶的细菌已经在全球范围内广泛播撒,中国也已经报道,造成了对碳青霉烯类、青霉素类、头孢菌素类和氨曲南在内的几乎所有β-内酰胺类抗菌药物耐药,并且产KPC酶的菌株种类正在增加,随时可能引起医院感染的爆发和流行,因此产KPC酶细菌的感染将是我们面临的严重问题,应引起微生物学家和临床医师的高度重视。

通过KPC酶的检测可了解一个地区的耐药现状及抗菌药物的使用情况,同时可发现有无产酶菌引起的感染爆发和流行。对产KPC酶细菌的治疗目前尚无特别有效的药物,通过进一步的研究可开发出新的抗KPC酶药物。因此目前研究KPC酶对临床、微生物实验室及新药研制均有十分重要的意义。