地中海贫血是一组遗传性溶血性贫血,其共同特点是由于珠蛋白基因的缺陷使血红蛋白中的珠蛋白肽链有一种或几种合成减少或不能合成,导致血红蛋白的组成成分改变。本组疾病的临床症状轻重不一,大多表现为慢性进行性溶血性贫血 。

本病以地中海沿岸国家和东南亚各国多见,我国长江以南各省均有报道,以广东、广西、海南、四川、重庆等省区发病率较高,在北方较为少见^{[ 1~ 6]}。若夫妻为同型地中海贫血的带因者,每次怀孕,其子女有1/4的机会为正常,1/2的机会为带因者,另1/4的机会为重型地中海贫血患者。因此,在遗传咨询及产前诊断方面,这是非常重要的疾病。通常将地中海贫血分为α、β、δβ和δ等4种类型,其中以β和α地中海贫血较为常见。

根据病情轻重的不同,β地中海贫血分为以下3 型:(1)重型,又称Cooley 贫血。患儿出生时无症状,至3~12个月开始发病,呈慢性进行性贫血,面色苍白,肝脾大,发育不良,常有轻度黄疸,症状随年龄增长而日益明显。本病如不治疗,多于5岁前死亡;(2)轻型。患者无症状或轻度贫血,脾不大或轻度大。病程经过良好,能存活至老年。本病易被忽略,多在重型患者家族调查时被发现;(3)中间型。多于幼童期出现症状,其临床表现介于轻型和重型之间,中度贫血,脾脏轻或中度大,黄疸可有可无,骨骼改变较轻。其中,轻型β地中海贫血为β地中海贫血基因突变杂合子,可无临床症状或症状较轻,容易漏诊。因此可以主要针对轻型β地中海贫血做进一步研究,对发展为重型有一定的预防和治疗意义。根据临床特点和实验室检查,轻型地中海贫血的临床表现和红细胞的形态改变与缺铁性贫血有相似之处,故易被误诊。因血红蛋白H(HbH)病贫血较轻,还伴有肝脾肿大、黄疸,少数病例还可有肝功能损害,故易被误诊为黄疸型肝炎或肝硬化。而采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)的高分辨率熔解曲线(HRM)分析可以避免误诊,很好地进行临床诊断^{[ 7]}。

HRM原理及应用实例:在PCR前将适当的荧光染料与反应缓冲液、引物、模版DNA等PCR反应液混合,然后将混合液加入96孔板或384孔板,并直接放入荧光定量PCR仪器中(如LC480),首先进行PCR,然后在一定的温度范围内将PCR扩增产物进行变性。在此期间,仪器的光学检测系统采集密集的荧光信号变化并绘制温度熔解曲线,根据曲线准确区分野生型、杂合突变、纯和突变,通过软件自动分型,从而区分不同位点发生的突变。

HRM技术优势:基于其与常规熔解曲线分析的方法类似,其操作方法也相当简便。在用HRM方法进行分析时,样本经PCR扩增后直接进行HRM,PCR产物无需再转入其他分析装置,而直接在同一个PCR管内进行分析,实现闭管操作。由于HRM完全是基于核酸的物理性质进行分析,因而无需序列特异性探针。基于这种检测原理,HRM检测不受突变碱基位点和种类的局限,既可以对未知突变进行筛查、扫描,又可对已知突变进行分析,亦可用于短片段重复序列的分析,所需要的只是在常规PCR基础上增加一个饱和染料。所以,相比传统的单核苷酸多态性(SNP)/突变分析法和定量探针法,简化了操作时间和步骤,大大降低了使用成本,并且拓展了其应用范围。HRM在这些方面的优势使其具有极强的可操作性,成为近年来国外新兴的遗传学、方法学研究和应用热点^{[ 8]}。

实验方法中可以使用生物学分析软件进行序列比对,针对β珠蛋白基因簇位于11号染色体短臂上(覆盖50 kb)基因设计引物,并使用商业化的饱和染料LC Green进行染色,对荧光PCR 反应条件进行优化, 验证方法的特异性、敏感性和重复性。同时对疑似β地中海贫血患者的临床样本进行检测。

近几年来国外大量研究工作已表明,HRM是一种大通量、快速、敏感性高、成本低、不受检测位点局限的闭管检测的突变与基因型分析方法^{[ 9, 10]}。其相关工作已获国际高等级杂志^{[ 11~ 13]}认可。在未来的突变筛查、基因型分析,特别是SNP相关研究中,HRM技术一定会得到广泛的应用。