引用本文
许学斌, 冉陆, 朱超. 沙门菌分型血清对比研究(上海市,1999至2007年). 25(1): 21-25
XU Xuebin, RAN Lu, ZHU Chao. A comparative study of the serotyping ofSalmonella(Shanghai,1999-2007) . Labratory Medicine, 25(1): 21-25  
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沙门菌分型血清对比研究(上海市,1999至2007年)
许学斌1, 冉陆2, 朱超3
1.上海市疾病预防控制中心,上海 200336
2.中国疾病预防控制中心,北京 100050
3.中国医学细菌中心沙门菌专业实验室,四川 成都 610063

作者简介：许学斌,男,1972年生,学士,副主任技师,主要从事肠道病原菌检测监测研究。

基金:全球沙门菌监测网、中美新发和再发传染病合作项目(1U2GGH000018-01);
摘要
目的

比对国产和进口沙门菌诊断血清,并了解本地区沙门菌血清型的分布和特征。

方法

对1999至2007年收集和分离的1 077株沙门菌进行血清学鉴定;2006和2007年全球沙门菌监测(GSS)项目病例分离沙门菌以泰国产血清的分型结果作为参照,分别和成都生物所、兰州生物所产血清进行分型比对试验。

结果

除肠炎沙门菌外,不同来源沙门菌间的优势血清型分布没有规律性特征。成都生物所血清与泰国血清的分型符合率为94. 4%(185/196);兰州生物所血清的符合率为89.9%(151/168),“H”相因子c、i、e,h、r、k存在交叉凝集现象,易产生错误的结果。包括GSS分离到的7个血清型在内确认有8株沙门菌血清型为国内首次报道。

结论

泰国产沙门菌诊断血清在使用性能、分群及分型能力和准确性方面均优于国产的配套血清。建议基层实验室在掌握正确的使用习惯和建立相对标准化的沙门菌分型及相位诱导方法的前提下,使用国产血清搭配部分泰国因子血清的组合,即能达到低成本和高效率的分型效果。

关键词: 沙门菌; 血清型; 符合率; 交叉凝集; 相位诱导
中图分类号:R378.2 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2010)01-0021-05
A comparative study of the serotyping ofSalmonella(Shanghai,1999-2007)
XU Xuebin1, RAN Lu2, ZHU Chao3
1.Shanghai Municipal Center for Disease Control and Prevention,Shanghai 200336,China
2.China Center for Disease Control and Prevention,Beijing 100050,China
3.Department of Salmonella Laboratory,China Center for Medical Bacteriology,Sichuan Chengdu 610063,China
Abstract
Objective

To explore the distribution and characteristics ofSalmonella serotyping in Shanghai by comparative study of home-made and importedSalmonella diagnostic sera.

Methods

Serological identification of 1 077 strains ofSalmonella isolated and collected from 1999 to 2007 was performed.Salmonella isolated from 2006 to 2007 in Global Salm-Surv (GSS) project was identified with sera made in Thailand as a reference control material and then was compared with theSalmonella diagnostic sera of Chengdu Biological Product Research Institute and those of Lanzhou Biological Product Research Institute.

Results

The distribution of predominant serotyping from different source had no regularity exceptSalmonella enterica. In comparison with the Thailand diagnostic sera,the coincidence rate of ChengduSalmonella diagnostic sera was 94.4%(185/196),and the coincidence rate of LanzhouSalmonella diagnostic sera was 89.9%(151/168). There were cross-agglutinations among c,i,e and h,r, k in H phase.These could make false results. Eight strains ofSalmonella including seven serotypings isolated from GSS were firstly reported in China.

Conclusions

Salmonella diagnostic sera from Thailand are better than those of home-made in performance, classification, typing and exactitude. Under the precondition of relative standardSalmonella typing and phase induction, home-made diagnostic sera combined with Thailand diagnostic sera may be applied in primary laboratory to accomplish an efficient and cost-effective serotyping.

Keyword: Salmonella; Serotyping; Coincidence rate; Cross-agglutination; Phase induction

自1995年以美国疾病预防控制中心(CDC)为主的多国、多部门合作建立的细菌分子分型国家电子网络(PulseNet)监测体系开始,由非伤寒沙门菌引发的许多公共卫生事件就被各种传媒广泛报道而影响到全球范围的相关食品贸易。作为我国经济、贸易发达地区,上海于2006年加入全球沙门菌监测(GSS)项目,完成2年的监测后发现非伤寒沙门菌的常规血清分型鉴定技术是影响各监测点菌株报告质量的重要原因之一。为了调查产生错误鉴定结果的原因,我们对沙门菌株进行多套血清的平行鉴定来比对诊断血清间的结果差异,并回溯和评估自1999至2007年本实验室血清学鉴定的全部沙门菌血清型,为今后提高菌型分型、报告的准确性提供实践和理论依据。

材料和方法
一、材料

1.实验菌株 1 077株沙门菌包括1999年385株体检株,2002年62株食品株,2003年42株食品株,2005年42株腹泻株,2006年253株腹泻株,2006年31株食品株,2007年225株腹泻株,2007年37株食品株。

2.培养基 胰大豆胨蛋白胨肉汤(TSB)、改良亚硒酸煌绿增菌液(MSBG)、罗伯特增菌液(RVS)、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板(XLD)、CHROMagarTM沙门菌显色琼脂平板(CAS)、“O”和“H”诱导软琼脂购自上海科玛嘉微生物技术有限公司,肠道双支糖综合鉴别管和其他辅助生化鉴定试剂由本中心供应室配制。以上增菌液和平板均避光10 ℃以下保存,在有效期内使用。

3.诊断血清 沙门菌分型诊断血清50种(成都生物制品研究所,简称成都所)、沙门菌分型诊断血清60种(兰州生物制品研究所,简称兰州所)、自选沙门菌分型诊断血清79种(S&A,Ltd,泰国),均避光10 ℃以下保存,在有效期内使用。

二、实验方法

1.食品样品非伤寒沙门菌检测 根据GB4789-2003和文献[1]中食品检测程序完成样品处理、分离初筛、菌株鉴定和血清分型等,生化反应符合并且血清抗原式完整者报告沙门菌血清型。

2.非伤寒沙门菌腹泻病例和GSS项目监测 按照文献方法[ 2]和《上海市沙门菌病监测方案》中粪便样品检测程序完成样品分离、初筛鉴定和血清分型,生化反应符合并且血清抗原式完整者报告沙门菌血清型。

3.国产和进口沙门菌血清分型结果的回顾性评价 2006年以前本实验室未加入GSS项目时所用沙门菌诊断血清为成都所产;2006年后沙门菌分型使用泰国S&A的诊断血清。比较2个时间段诊断沙门菌的型别分布特征。全部菌株鉴定均参照Kuffman-White抗原表(2001年版)进行血清学诊断,凡出现国内罕见沙门菌血清型由成都所下属中国医学细菌中心沙门菌专业实验室鉴定复核。

4.沙门菌血清比对试验 2006年各GSS项目监测点报告的196株沙门菌统一先使用成都所产的诊断血清进行分型,然后再用泰国产诊断血清重新进行分型,同时进行人员比对(避免由同一人进行血清学比对试验);2007年GSS的168株沙门菌的比对要求同前,血清更换为兰州所产诊断血清。

结果
一、人源和食源沙门菌血清型的分布特征

食品从业人员(1999年)分离的沙门菌主要血清型以阿贡纳和德比最常见,其次为鸭伤寒、鼠伤寒、肠炎、阿伯丁、伦敦、山夫登堡、乙型副伤寒、里定等;腹泻者分离(2005、2006和2007年)的沙门菌主要血清型则以肠炎、鼠伤寒为优势,阿伯丁、山夫登堡、汤卜逊、婴儿均比阿贡纳和德比相对多见。食源性(2002、2003、2006和2007年)分离的沙门菌血清型以德比、肠炎、鼠伤寒最常见。不同来源沙门菌型的构成中除肠炎占有较为明显优势外,其他在各自标本中占有优势构成的血清型(如食品中的德比、腹泻患者中的山夫登堡和阿伯丁)之间缺少相关的趋向性分布,均各自有不同的优势型别。

二、国产与进口诊断血清鉴定沙门菌型结果的回顾性分析

1999至2005年所有收集和分离的沙门菌均使用成都所血清鉴定,血清分型的结果共涉及8个血清群、52个不同型别,除1株为M群外,其他均在A~F群范围内,优势血清群依次为B、C1、C2-3、E1群;2006至2007年GSS监测和同期的食源性等综合监测分离的沙门菌统一使用泰国产血清鉴定,血清分型的结果共涉及12个血清群、61个不同型别,除A~F群外,还有G、I、M、Q群,优势血清群依次为C1、C2-3、B、E1群。泰国产沙门菌诊断血清在产生肉眼可见的凝集颗粒时间(使用性能)、分群及分型能力和准确性方面均优于国产血清的分型效果。2005年以前分离鉴定的血清型而2006至2007年间未能分离的有:里定(4:e,h:1,5)、彻斯特(4:e,h:e,n,x)、伤寒(9:d:-)、巴拿马(9:1,v:1,5)、钦哥拉(11:e,h:1,2)等。不同品牌的分型血清在不同时间段产生型别间差异的原因可能和诊断血清品牌的特异性和使用效果有一定的关系,但不能排除客观上由于系统开展针对临床腹泻患者和可能作为潜在传染源的食源性样品的GSS监测,以及使用了敏感的检测方法分离到相对多的阳性菌株的事实。见 表1。

表1 2种品牌血清在不同时间显示沙门菌分型结果
三、确认国内首次分离到的沙门菌血清型

目前已有8株均为国内首次分离报道,并均经中国医学细菌中心沙门菌专业实验室鉴定复核。见 表2。

表2 上海市首次确认分离到的沙门菌型别
四、2种国产诊断血清和泰国诊断血清的比对结果

2006年GSS报告的196株沙门菌腹泻株经过2种不同来源沙门菌诊断血清比对确认,共有185株血清型的报告结果一致(符合率94.4%,185/196),余下11株血清型有分歧的鉴定结果除2株超出成都所50种沙门菌诊断血清的鉴定范围外(1株为非A~F群,1株为C2-3群),其余的9株中有2株为“O”群的诊断错误;“H”相结果有4株为第1相诊断错误(44.4%,4/9),3株为第2相诊断错误。而2007年GSS报告的168株沙门菌腹泻株经过2种不同来源沙门菌诊断血清比对确认,共有151株血清型的报告结果一致(符合率89.9%,151/168),余下17株有2株为“O”群的诊断错误;“H”相结果有12株为第1相诊断错误(70.6%,12/17),1株为第2相诊断错误,3株为第1和2相均错误的型别。见 表3。

表3 成都所、兰州所诊断血清和泰国诊断血清比对沙门菌分型试验
讨论

由沙门菌污染传播的食源性散发或暴发案例已经在全球范围内产生了巨大的影响,2008年鼠伤寒沙门菌在全球范围内的肆虐事件尤其令人印象深刻。国际现行公认的沙门菌诊断的“金标准”方法仍是以血清学分型为准。2001年开始在世界卫生组织(WHO)主导下的全球性沙门菌及食源性监测项目中,实验室技术培训重点之一是建议使用符合质量要求的诊断血清,通过参与国网络协作实验室之间的评价,推荐各监测点使用泰国产的沙门菌诊断血清。而此前国内的大多数实验室长期以来一直依靠国内2个生物所生产的成套化分型血清来完成沙门菌的分型,对此我们认为在GGS项目中有必要以泰国血清作为参比血清,鉴定沙门菌的同时来比对2种国产血清的分型结果,为整理和追溯沙门菌型的历史记录提供准确和科学的评价。

通过血清品牌间比对表明,测试的沙门菌“O”和“H”相位凝集结果在国产与泰国产血清之间存在较大差异。在“O”相位确认中,泰国的O群因子血清在玻片出现肉眼可见的凝集反应时间和颗粒数上优于国产血清,国产成都所血清的O群因子产生特异性凝集颗粒的时间慢于兰州所,但没有兰州所存在的O群因子之间的相互交叉凝集现象,表明在特异性上国产成都所血清与泰国产血清之间差异不大,一般有工作经验者不会出现“O”相位的“误判”。 在“H”相位确认中,泰国的H因子血清大多数凝集颗粒清晰,也有少数几个H相因子存在部分的交叉凝集或假凝集现象(e,h、c、d、z15);而成都所和兰州所的H相因子血清除存在H2、5、6、7间的交叉凝集外,还有部分c、i、e,h、r、k等因子在血清的诊断上有分歧,单以出现H1或2相因子间的交叉凝集频率统计,兰州所血清多于成都所。对此次进行血清比对的全部分型结果分析,成都所和兰州所血清与泰国产血清鉴定结果之间的符合率分别为94.4%(185/196)和89.9%(151/168),成都所血清的总体分型效果优于兰州所。

一方面因为国内实验室在缺少系统的沙门菌血清学培训前提下,不宜完全自主选择泰国产血清数量,另一方面必要依靠经验丰富的技术人员,仅使用成都所和兰州所现成配套分型血清进行比对鉴定沙门菌,才能达到90%左右的可信度,但仍存在无法鉴定非“A~F”沙门菌的先天不足。所以我们认为,部分有条件的实验室在“O”相位因子血清中可挑选(非成套购买)国产品牌的因子血清作为确认群因子的血清,而对“H”相位因子确认(特别是已存在交叉凝集的因子血清)建议选择购买泰国产因子血清来配伍使用,其产生的总体成本效益应能被基层实验室接受。

除了分型血清的选择是鉴定沙门菌过程中重要的影响因素以外,实验室技术人员操作经验的获得和细化的沙门菌分型流程(SOP)建立及是否有及时更新的沙门菌抗原表等也是间接影响因素之一。作为GSS核心实验室的丹麦国立实验室早就建立了沙门菌O和H相分型诊断的操作流程和专用培养基的方式,提示我们需要引进这种标准化的方法来避免人员和材料对分型结果可能产生的影响和干扰,使结果稳定和可重复。另外,为提高本市临床实验室在沙门菌常规分离和分型的能力,应增加对包括新版沙门菌抗原表在内的沙门菌分型的专业培训和宣教。

最新Kuffman-White抗原表(2007年版)显示沙门菌血清型已达2 579个,而国内有分离报道的仅有300多个,产生如此悬殊的差异可能是国内长期用于分离的方法、分离材料和诊断血清等诸多问题累加造成的。回顾性分型数据表明,2006年以前本实验室内分离的沙门菌用成都所血清分型,结果除1例偶见临床腹泻株为国内首见的M群波摩那沙门菌外,其余均属A~F群,按照GSS方案分离的沙门菌型不论在国内首见的菌型数(7株)还是在非A~F群菌型数(5%)上,均与2006之前的结果有极大的反差,所以我们认为选择敏感的沙门菌监测方法能够为客观发现沙门菌血清型的优势分布和罕见血清型的分布特征提供总体或局部的流行病学信息,在此基础上评价实验室沙门菌分型能力是有意义的。这一点,我们通过GSS项目的实施得到充分肯定[ 3, 4]。

对诸多小型实验室而言,复杂的生化鉴定和血清分型鉴定意味着除了需要技术人员具备丰富的经验外,还需付出高昂的成本,而分子生物学鉴定技术在硬件和应用技术上也存在一定的局限性[ 5]。所以我们推荐基层实验室使用简易的沙门菌鉴定流程,避免依赖主观经验和使用昂贵的生化编码系统[ 2],并在此基础上配置合理有效的诊断血清,分阶段逐步建立从血清分群到分型的沙门菌分型技术。对检出罕见沙门菌或少见型别的“孤立”案例需要由具有资质的参比实验室逐级鉴定完成,这样才能有助于提高临床微生物实验室对沙门菌的鉴定水平和准确性。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] 许学斌, 顾宝柯, 袁政安, 等. 富营养预增菌液在肉制品沙门菌常规检测方法中替代效果研究[J]. 中国人兽共患病学报, 2006, 22(7): 633-635, 664. [本文引用:1]
[2] 许学斌, 顾宝柯, 陈敏, 等. 沙门菌检测方法的优化[J]. 检验医学, 2007, 22(6): 677-680. [本文引用:2]
[3] 顾宝柯, 袁政安, 金汇明, 等. 上海市沙门菌病流行特征分析[J]. 环境与职业医学, 2008, 25(3): 245-247. [本文引用:1]
[4] 朱超, 许学斌. 沙门菌属血清型诊断[M]. 上海: 同济大学出版社, 2009: 86-131. [本文引用:1]
[5] Hu Q, Coburn B, Deng W, et al. Salmonella enterica serovar Senftenberg human clinical isolates lacking SPI-1[J]. J Clin Microbiol, 2008, 46(4): 1330-1336. [本文引用:1]