首先在Tp基因文库中筛选所需目的基因序列, 通过聚合酶链反应(PCR)扩增获得目的基因, 再将目的基因克隆并通过原核生物或真核细胞诱导表达Tp抗原蛋白。此外, 目的基因也可以通过化学合成或生物拼接的方法获得。目前, 已成功重组的Tp抗原基因有TpN15、TpN17、TpN19、TpN29-35(TpD)、TpN44.5(TmpA)、TpN47、TpN37、TpN36(TmpB)、TpN35(TmpC)、TpN0453、TpN92、Gpd、TprK等, 其中已通过原核生物成功表达并对Tp血清学诊断有重要研究价值的主要有TpN15、TpN17、TpN47、TmpA 4种, 现将其分述如下。

1. 47 000蛋白 47 000蛋白是Tp外膜蛋白中含量最高的成分之一, 存在于梅毒的整个病程中, 包括晚期隐性梅毒, 尤其对伴有人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的梅毒患者, 在抗Tp抗体含量低于一般梅毒患者的情况下亦能检测到。编码47 000蛋白的基因(TpN47)长1 302 bp, 相对分子质量为47 645, 等电点为5.4。Chamberlain等^[2]采用含依赖T7RNA多聚酶的表达载体, 建立了高效表达重组47 000系统, 并将该抗原与自Tp中分离得到的47 000蛋白进行生物学比较, 结果表明来源不同的2种抗原具有相同的生物学特性。Norris^[3]进一步研究发现, 该表达产物和天然47 000蛋白氨基酸序列一致, 均由367个氨基酸残基组成, 具有高度免疫原性, 家兔在接种7~10 d后即可产生抗47 000蛋白抗体, 开始以IgM为主, 以后逐渐产生IgG, 但与细弱密螺旋体和地方性密螺旋体亚种抗原成分有交叉反应。

2.17 000蛋白 17 000蛋白是Tp特异性含量丰富的外膜蛋白抗原, 存在于各期梅毒患者病灶中。17 000蛋白基因(TpN17)长468 bp, 编码156个氨基酸, 相对分子质量为16 451, 等电点为8.7。徐磊等^[4]将TpN17连接于PGEX 4T-1表达载体, 通过大肠埃希菌BL21菌株大量表达17 000脂蛋白, 并将表达产物与同期制备的47 000蛋白通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测40份不同来源的血清样本吸光度值, 结果证明, 通过原核生物系统表达的TpN17与TpN47抗原均保持天然Tp抗原性, 前者反应性强, 后者则具有更强的特异性。

3. 15 000蛋白 15 000蛋白的基因(TpNl5)长426 bp, 相对分子质量为15 654, 等电点为7.34。15 000蛋白在Tp膜蛋白中含量相对较少, 但在免疫印迹试验(western blot, WB)中与人梅毒血清间显示了超强的反应性。Centurion-Lara等^[5]用纯化的重组TpNl5蛋白免疫家兔, 结果表明该蛋白对Tp感染无保护作用, 同时证明TpNl5的DNA序列在不同的螺旋体种和亚种中是一致的, 无明显差异。

4. 42 000蛋白 42 000蛋白基因(TmpA)长1 035 bp, 相对分子质量为42 000。Schouls等^[6]构建了能在大肠埃希菌K-12中大量表达42 000蛋白的质粒载体pPLc245。Ijsselmuiden等^[7]用间接ELISA探讨了重组TmpA抗原在血清学诊断中的意义, 对148例未治疗和167例已治疗的梅毒患者血清以及190例非梅毒患者血清进行了检测, 其敏感性分别为:一期梅毒76%、二期梅毒100%、早期隐性梅毒98%。在治疗后1年以内的梅毒患者中, 抗TmpA抗体滴度明显下降, 表明TmpA不仅在梅毒血清诊断中有意义, 而且可望用于梅毒疗效的监测。

Wang 等^[8]检测970例血清的结果表明, 在敏感性上4种重组抗原的密螺旋体临床快速诊断效果与Tp血凝试验(Tp hemagglutination assay, TPHA )无显著差异。但有研究证实, 单一梅毒基因重组抗原对潜伏晚期、合并HIV感染或经过治疗的梅毒患者反应性差, 常出现假阴性结果, 而多基因嵌合重组抗原则可以获得更好的结果^[9]。常用的嵌合基因有TpN15-17、TpN15-47、TpN17-47、TpN15-TmpA、TpN15-47-17、TpN15-47-TmpA、TpN15-47-17-TmpA、TpN15-47-17-37-TmpA。

1. Tp-ELISA 用基因重组抗原包被聚苯乙烯反应板微孔, 以酶标记抗人IgG/IgM作为第2抗体, 可测Tp IgG、IgM。另有一种试剂盒为双抗原夹心ELISA, 包被反应板的和酶标记的都是重组抗原。Young等^[10]以3种组合表达蛋白(TpN15、TpN17、TpN47)为抗原的ELISA(ICE- ELISA)与TPHA、荧光密螺旋体抗体吸收试验(fluorescent treponemal antibody absorption test, FTA-ABS)、性病研究实验(venereal disease research laboratory, VDRL )及以自然Tp为抗原的ELISA(seletsyph-G ELISA)进行比较, 结果显示ICE-ELISA对各期梅毒检测的特异性和敏感性均高于其他方法, 对15例伴随HIV感染的梅毒感染者进行检测, 结果ICE- ELISA检出率为100%, 而seletsyph-G ELISA漏检3例, 从而证明ICE-ELISA优于其他方法。Marangoni等^[11]用重组抗原TpN17-15-ELISA与TPHA、WB平行检测了含正常人和6种不同疾病的2 590份血清样本, 结果ELISA和WB无交叉反应, 优于TPHA。陆原等^[12]以Tp嵌合基因重组抗原(rTpN15-17-47)及单一抗原TpN47分别构建双抗原夹心和间接ELISA, 并平行检测50份Tp阳性和30份Tp阴性血清, 结果证实嵌合基因重组抗原较单一基因重组抗原敏感性高, 双抗原夹心ELISA优于间接ELISA。Martin 等^[13]对间接ELISA检测患者血清中的抗体水平进行标准化研究, 对127例梅毒阴性血清和 37 例Ⅱ 期梅毒血清的检测结果表明, 商业化ELISA中常用的4种重组抗原的特异性和敏感性均为100%。

2. 免疫层析实验 用基因重组Tp抗原包被膜条测试区, 当待测样本中的Tp IgG/IgM与膜条上标记的抗人IgG/IgM反应时, 复合物通过膜条的毛细管效应层析至测试区并与包被的特异抗原结合, 出现呈色的条带为阳性。王林娜等^[14]对4种不同国家生产的免疫层析试剂盒进行评价, 以TPHA作为评价标准, 平行检测860例血清和全血样本(孕前体检44例、婚检74例、非婚性接触745例), 结果Abbott Determine Syphilis TP test(美国)、SD BIOLINE Syphilis 3.0 test(韩国)、VISITECT— SYPHILIS test(英国)、Syphicheck— WB test(印度)试剂盒的血清/全血试验敏感性分别为100.0%、95.5%、94.0%、67.4% / 81.9 %、87.6%、73.5%、64.0%, 特异性分别为98.9%、97.9%、98.1%、98.8% / 99.4%、99.4%、99.7%、99.7%, 认为部分以重组抗原为基础的快速诊断试验, 与以往的确诊实验(如TPHA、FTA-ABS等)具有可比性, 而且价廉、便利, 试验结果可快速获得(15~20 min), 有望取代传统的筛查及确证试验。

3.将Tp基因重组抗原经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE), 电转印至硝酸纤维素或聚偏氟乙烯(PVDF)膜上, 与待测血清反应后再用酶标记抗人IgG/IgM检测。如待测血清中存在抗Tp相对分子质量为15 000、17 000、42 000、47 000、37 000的特异性抗原的抗体时, 在加酶底物/色原物质反应后, 可出现呈色条带。Sambri等^[15]用5种重组多肽(rTpN47、rTpN17、rTpN15、rTpN42、rTpN37)建立WB(recWB), 与微量红细胞凝集(MHA-Tp)和以自然Tp为抗原的WB(wclWB)对比检测450份梅毒血清。用MHA-Tp作为参考, 其特异性和敏感性(98.9%、97.1%)高于wclWB(97.1%、96.1%), 同时以wclWB为参考, 其敏感性和特异性分别为98.9%和99.3%。由此认为, recWB明显优于wclWB, 是一种较好的梅毒确诊实验方法。

4. 快速乳胶凝集试验 快速乳胶凝集试验原理类似于Tp颗粒凝集试验(Tp particle agglutination assay, TPPA)。Young等^[16]建立了应用15 000、17 000、47 000为抗原的快速检测梅毒的快速乳胶凝集试验, 检测了1 518份随机血清样本, 并与seletsyph-G ELISA和VDRL的特异性进行比较, 同时还检测99份各期梅毒患者血清和15例筛检阳性血清, 对其敏感性进行评价。结果显示其特异性(99.8%)高于seletsyph-G ELISA (99.2%)和VDRL(99.1%), 敏感性(93.0%)与seletsyph-G ELISA(92.1%)无显著差异。认为快速乳胶凝集试验可望成为一种特异性高、检测速度快、操作简便的梅毒筛查方法。

5. 化学发光免疫分析(CLIA) 应用Tp重组抗原包被化学发光微孔板作为固相抗原, 用辣根过氧化物酶(HRP)标记第2抗原蛋白, 用含鲁米诺及其增强剂的化学发光底物作示踪剂, 经化学发光分析仪测量发光计数值。詹先发等^[17]以Tp抗原15 000、17 000、47 000蛋白作为固相抗原和酶标抗原, 建立了Tp双抗原夹心CLIA, 并与甲苯胺红不加热血清试验 (toluidine red unheated-serum test, TRUST )、TPHA、TPPA、Tp-ELISA平行检测50例Tp抗体阳性和390例Tp抗体阴性血清, 结果CLIA阳性符合率和阴性符合率均为100%, 其他4种检测方法的阳性符合率分别为68.0%、97.5%、94.0%、100.0%, 阴性符合率为96.0%、100.0%、99.0%、99.0%。利用该试剂盒检测88例自身免疫性疾病、92例孕妇和1 200名正常人血清, 结果均为阴性, 说明该试剂盒具有很好的特异性。

目前应用于商品化生产及临床检测的重组梅毒抗原主要是TpN15、TpN47、TpN17、TmpA。初期的试剂盒多采用单片段抗原, 现已逐步被多表位嵌合抗原代替。尽管如此, 这些重组抗原并不能检测出所有各期梅毒, 而且对于哪一种抗原具有更高的特异性和敏感性尚无一致观点^[18]。随着免疫学及其技术的发展, 使得原来难以从Tp中纯化的微量蛋白能够用重组技术大量获得, 并对其性能进行研究^{[19, 20]}。有学者推测微量Tp外膜蛋白(Tromp)表面可能是致病力决定区和宿主免疫介导区。 实验证实Tromp1、Tromp2、Tromp3具有抗原性和免疫原性, 且与Tp病理及传染有关; 部分Tp基因家族成员在不完全免疫反应中起关键作用^[21]; 某些重组蛋白如 Tp19、Tp36 、Gpd、Tp92、Tp0155、 Tp0483 、Tp0751等在动物感染模型中具有免疫保护作用等。这些发现可望为Tp的实验室诊断提供更理想的方法, 同时也为其免疫致病机制及多肽疫苗研究提供候选基因。