AmpC酶是由ampC基因编码的“ 丝氨酸” 头孢菌素酶, 主要由肠杆菌属、不动杆菌属、枸橼酸杆菌属、摩根摩根菌属等革兰阴性杆菌产生。ampC作为结构基因受到ampD、ampR、ampG、ampE的调控, 从而影响AmpC酶的表达。最近有文献归纳指出, 在临床分离株中AmpC酶高表达的原因依次为:ampD> ampR> ampG。其中, ampD是ampC的调控基因之一, 通过编码AmpD酶蛋白而负性调节AmpC酶的表达^{[2, 3]}。

AmpC酶属β -内酰胺酶分类Bush-J-M1群, 在分子分类上属“ C” 类酶。

根据产酶水平高低和ampC基因表达方式不同可分为:(1)持续高产型或去阻遏突变型:即与ampD相关的一种ampC基因表达方式, 质粒介导的AmpC酶一般以此种类型为主。既往的研究表明, ampD 的突变频率高达10^-5~10^-8, 且β -内酰胺类抗菌药物对这种突变具有选择作用; (2)持续低产型:又称基础型, 因缺乏ampR调控基因而低水平非诱导性表达AmpC酶, 大部分大肠埃希菌属于此种类型; (3)高诱导型:一般在有合适的诱导物存在的条件下, 可使AmpC酶的表达水平增加10~100倍^[4]。当去除诱导剂后, 酶表达水平将恢复到正常基础水平。有文献指出, ampD的突变也可以影响这一型AmpC酶的表达水平, 导致细菌持续产生中等量到极大量的的AmpC 酶(部分或完全去抑制型) , 或导致细菌在诱导因子存在时的产酶量大大超过野生型菌株在诱导因子存在时的产酶量(高诱导表型)^[5]; (4)野生型:即通常所指的染色体介导的诱导型AmpC酶。

根据来源不同, AmpC酶可分为染色体介导型和质粒介导型, 其中以染色体介导为主。(1)染色体介导的AmpC酶:即染色体编码的AmpC酶, 几乎所有的肠杆菌科细菌(除沙门菌和克雷伯菌)和铜绿假单胞菌都可产生; (2)质粒介导的AmpC酶:是一组来源于不同细菌染色体的异质酶, 有AmpC酶典型生化特性和耐药性, 但其水解底物范围更广, 常具有多重耐药的特点^[6], 最常见于肺炎克雷伯菌, 其次是大肠埃希菌、奇异变形杆菌和沙门菌^[7]。质粒介导的AmpC酶, 最早发现于美国(1988年), 自此以后就有40多种质粒介导的AmpC酶在全球范围内陆续被报道^[8]。

1.amp复合操纵子是一个典型的ampC基因调控模型^[9], 由不连锁基因ampC、ampD、ampR、ampG 、ampE构成, 其编码产物参与调节ampC的表达。ampC是AmpC酶的结构基因, 编码以丝氨酸为活性中心的C类β -内酰胺酶。而ampD基因位于远端染色体nadC-aroP区上, 编码一种细胞质中可溶性的 N-乙酰葡萄糖胺-L-丙氨酸酰胺酶, 参与肽聚糖在细胞内的再循环过程。ampR是ampC基因的转录激活子, 编码反式作用蛋白AmpR— — 细菌调节因子LysR家族。ampG编码跨膜转运蛋白AmpG, 感受肽聚糖量的变化并通过AmpR激活ampC。其中AmpG(渗透酶)和AmpD(细胞酰胺酶)参与细胞壁的代谢。ampE编码细胞膜蛋白AmpE, 间接协助ampD对AmpC的阻遏作用, ampE起始密码子与ampD TGA终止密码子重叠, 说明这2个基因共同组成一个操纵子。

2.AmpC 酶的调控与细胞壁糖肽再循环有关, 在4个调节基因中, ampD-ampR与AmpC酶去阻遏高表达有极为密切的关系。正常情况下, AmpD蛋白和AmpR蛋白以复合体形式抑制ampC基因的转录 ^[10~12]。在没有β -内酰胺诱导剂作用下, AmpR调节蛋白通过直接与肽聚糖前体UDP-N-乙酰胞壁酰五肽(细胞壁合成的重要前体)结合而维持在一种非活动状态。在这种状态下, AmpR结合在结构基因ampC和ampR之间的操纵子位点, 导致ampC表达受阻, 并且在这种状态下, 对ampR也有很弱的抑制作用, 即负的自我调节作用。当β -内酰胺类抗菌药物等诱导剂存在时, 细胞壁肽聚糖的合成受阻, 降解产物在胞周间隙大量堆积, 在ampG作用下转运至胞浆内并形成N-乙酰胞壁酰三肽, 即ampD的降解底物之一, 其可与配体竞争结合AmpR, 从而恢复AmpR激活ampC转录的功能。由于AmpC酶的诱导表达与细菌细胞壁肽聚糖代谢存在密切的相关性, 近年来, Garcia等^[13]在研究中通过建立ampD缺失的突变体模型来评价肽聚糖循环中断对生长特征的影响, 并在革兰阴性细菌中发现, ampD突变体胞质中积聚大量的肽聚糖单体, 从而影响肽聚糖片段的释放, 而ampG和ampD双突变体则可以使释放双糖的能力恢复到野生水平。在AmpC酶表达的基因调控系统中, 还发现ampD基因敲除或β -内酰胺类抗菌药物的诱导作用都可以解除AmpR的抑制作用, 这不仅可以导致临床分离株染色体AmpC组成性高水平表达, 还可以造成质粒介导的AmpC组成性高产。由此可见, ampD在AmpC酶组成性高表达中起着重要的作用。

3. ampD与AmpC酶去阻遏表达。有文献指出, 与ampD基因突变有关的AmpC酶去阻遏表达有3种表型:稳定去抑制型、高诱导去抑制型及温度敏感型, 其中与临床治疗失败密切相关的是去阻遏持续高产型^[14]。下面就近几年来与ampD相关性高产AmpC酶的耐药机制— — 去阻遏AmpC酶高表达方面做论述。

AmpC酶去阻遏表达与ampD基因缺失或ampD的低表达有关^[15]。归根结底, 最常见的原因是ampD的突变。AmpD的去抑制突变包括点突变、切除突变、插入突变^[3], 其中最常见的是甘氨酸-148-丙氨酸的突变。去阻遏高产型和高度诱导型的ampD基因突变位点不同, 去阻遏高产突变株的氨基酸改变主要位于蛋白质的羧基端, 高产突变株的氨基酸突变位点的位置并不固定, 突变多发生在AmpD蛋白的活性中心或保守序列区 ^[14]。当然, 也存在一些不常见的原因, 如ampD基因的重排。Bratu等^[16]的研究显示, 在10株高表达ampC的耐头孢他啶菌株中有6株发生了ampD基因重排, 产生了与组成性去抑制突变体相符的非诱导型AmpC酶。

去抑制表达的分类包括2种:第一, 完全性去抑制, 即ampD 3种同系物(ampD1、ampDh2和ampDh3)同时缺失的状态, 高表达AmpC且不可以被诱导。2006年, Juan等^[17]研究发现, 在铜绿假单胞菌中, 完全性去抑制表达的上调通过三步增强机制来表现4种相关的表达状态及耐药表型:基本水平的诱导表达; 适度水平诱导表达导致抗假单胞菌属的β -内酰胺类耐药性增强; 高水平诱导表达产生高水平β -内酰胺类耐药; 极高水平的去抑制表达而不再增加原有高水平的β -内酰胺类的耐药性。简言之, 3种ampD同系物协同抑制通过编码3种ampD同系物来完成ampC的逐渐增量调节。而其中任何一个ampD同系物的失活并不能改变或影响其他ampD基因表达; 第二, 部分性去抑制。只有在微生物ampC组成性表达的水平比野生株高时发生, 且基因仍然可以被诱导。关于部分性去抑制的可诱导性, 2007年Wolter等^[11]也曾报道过, ampC去抑制表达可在接触β -内酰胺类抗菌药物后被显著地选择出来。另外, 还有文献甚至指出, 在ampD的同系物中, ampDh2和ampDh3的表达是可以被诱导的。

ampD的同系物包括ampD1、ampDh2和ampDh3, 他们对AmpC表达的影响作用如下:ampD1> ampDh3> ampDh2。野生株PAO1的 ampD1和ampDh3 基因能够补充ampD缺陷的大肠埃希菌, 然而ampDh2则不能。Moya等^[18]通过了解ampD基因沉默对细菌适应性和毒力的影响, 来进一步探究铜绿假单胞菌中多样复杂的ampD同系物的生物学功能。在小鼠模型中, 他们确证了另外ampD基因的存在, 即ampDh2和ampDh3, 正是他们的存在使得铜绿假单胞菌ampD基因失活并不影响自身的适应性和毒力, 但ampD基因失活介导的ampC部分性去抑制则是铜绿假单胞菌有效耐药的机制, 其中ampDh3与铜绿假单胞菌毒力的相关性最大。最近, 在大肠埃希菌中还确定了一种AmpD的同系物— — AmiD。AmiD位于细胞外膜, 切断胞壁肽或无水胞壁肽中N-乙酰胞壁酸和L-丙氨酸之间的连接键, 是大肠埃希菌中第2个无水胞壁酸-N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶。AmiD有较广的底物谱的原因是与AmpD相比较而言, 其活性部位更容易接近。AmiD还可通过降解细胞周质中生物活性复合物, 成为这些环境中细菌逃避先天固有免疫反应的第2种策略^[18]。

综上所述, AmpC酶已经成为耐β -内酰胺类抗菌药物机制中不可忽视的一环, 国内外对其研究也上升到了一定的高度, 从最初的染色体介导的AmpC酶到质粒介导的AmpC酶, 从非诱导的质粒AmpC酶到可诱导的质粒AmpC酶, 无疑都是一种进步。至于在导致AmpC酶高产方面, ampD到底占据什么样的地位?我们已经做出简单概述。最后, 我们想阐述2点:(1)对于ampD的研究, 大部分集中在基因突变这个点上, 是否可以扩展到面, 从而发现突变以外的可以导致AmpC酶高产的机制; (2)从DNA水平到蛋白水平, 即ampD的突变— 氨基酸的变化— AmpD的表达— AmpC酶的高表达, 是否存在一种可行途径, 从而准确有效的验证这种因果关系。

总之, 细菌利用许多“ 工具” 来产AmpC酶, 从而抵御抗菌药物的侵袭, ampD恰恰是被利用的“ 工具” 之一。且由于检测AmpC酶技术的艰难复杂, 从而使人们对细菌耐药的认识不够清楚。为预防和控制临床微生物耐药情况的增加, 我们必须一一破解“ 工具” 之谜, 合理地应用抗菌药物, 开发并利用高科技手段简便、快速和准确地对耐药情况进行监测。