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李建军, 颜秉兴. 用微量肉汤稀释法检测葡萄球菌诱导克林霉素耐药的状况. 2009, 24(8): 610-612
  
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用微量肉汤稀释法检测葡萄球菌诱导克林霉素耐药的状况
李建军, 颜秉兴
濮阳市油田总医院检验科,河南 濮阳 457001

作者简介:李建军,男,1964年生,学士,副主任技师,主要从事临床微生物学检验工作。

摘要
目的

调查微量肉汤稀释法单个孔内红霉素和克林霉素结合诱导葡萄球菌对克林霉素耐药的能力,为仪器自动化检测提供依据。

方法

以D-试验结果作为“金标准”。红霉素/克林霉素在微量稀释板孔内有4种组合,浓度分别为4/0.5、 6/1、8/1.5、0.5/2 μg/mL,35 ℃ 24 h孵育,孔内有菌生长为诱导耐药阳性。菌株鉴定用API Staph。

结果

4/0.5、6/1、8/1.5 μg/mL 3种红霉素/克林霉素联合浓度与“金标准”符合率分别为100.0%、99.0%和100.0%,其中D-试验阳性2株、克林霉素最低抑菌浓度(MIC)为2 μg/mL的凝固酶阴性葡萄球菌在联合浓度为6/1 μg/mL时孔内无菌生长。当联合浓度为0.5/2 μg/mL时,与“金标准”符合率较低。

结论

4/0.5、6/1、8/1.5 μg/mL 3种红霉素/克林霉素联合浓度均可用于自动化仪器检测诱导克林霉素耐药。

关键词: 葡萄球菌; 诱导耐药; 最低抑菌浓度
中图分类号:R446.5 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2009)08-0610-03

纸片法检测葡萄球菌的诱导克林霉素耐药试验(即D-试验)最初由Fiebelkorn等[1]描述, 2004年当时的美国国家临床实验室标准化委员会(NCCLS)制定了该试验纸片扩散法操作规程[2]。尔后, 能否用稀释法检测诱导试验成为各学者争论的焦点[3]。2007年美国疾病预防与控制中心(CDC)联合其他10个实验室, 用微量肉汤稀释试验观察红霉素和克林霉素的4种联合浓度检测诱导克林霉素耐药的效果, 敏感性为98%~100%, 特异性为100%[4]。2008年美国临床实验室标准化研究所(CLSI)采纳CDC的研究成果, 将微量肉汤稀释试验单个孔内红霉素(4 μ g/mL)、克林霉素(0.5 μ g/mL)作为检测诱导克林霉素耐药的标准[5]。我们参照文献[4], 对我院的283株D-试验阳性和50株D-试验阴性(纸片法)葡萄球菌进行了诱导克林霉素耐药检测。

材料和方法
一、材料

1.菌株来源 2006年1月至2008年3月从濮阳市油田总医院临床各科室送检标本, 包括脓液、创面分泌物、血、耳及窦道分泌物等分离培养所得。

2.培养基 水解酪蛋白胨(MH)平板、5%羊血平板。含10 mg/L钙离子、10 mg/L镁离子的MH阳离子调节肉汤委托珠海黑马生物工程有限公司配制, 其中酪蛋白水解物、淀粉为美国Sigma公司产品。

3.抗菌药物 (1)克林霉素最低抑菌浓度(MIC)板制备:称取86.5%的克林霉素100 mg, 溶于去离子水至86.5 mL, 即1 000 μ g/mL, 取其2.56 mL加去离子水至10 mL, 浓度256 μ g/mL, 再倍比稀释至0.125 μ g/mL。按顺序把每个稀释度的药物包被到测试板上, 每孔25 μ L, 冷冻真空干燥。用前加入100 μ L阳离子调节MH肉汤, 使克林霉素最终浓度为0.03~64 μ g/mL; (2)红霉素MIC板制备:使红霉素溶于95%的乙醇, 再用去离子水稀释, 其余过程同(1), 红霉素最终浓度为0.125~256 μ g/mL; (3)红霉素/克林霉素联合MIC板制备:从1 000 μ g/mL的红霉素中取240 μ L, 从1 000 μ g/mL的克林霉素中取40 μ L, 加去离子水至10 mL, 其余过程同(1), 最终浓度红霉素为6 μ g/mL, 克林霉素为1 μ g/mL。以同样方法也可制备4/0.5、6/1、8/1.5、0.5/2 μ g/mL的红霉素/克林霉素MIC板。以上4种MIC板均委托珠海黑马生物工程有限公司配制。克林霉素、红霉素为中国药品生物制品检定所标准品; (4)红霉素(15 μ g)及克林霉素(2 μ g)纸片:购自北京天坛生物技术有限公司。

4.质控菌株 金黄色葡萄球菌(ATCC 25922)作为阴性对照。

二、方法

1. 菌株分离鉴定与复苏 标本接种羊血平板35 ℃ 24 h孵育, 用API Staph进行菌株鉴定。将保存的D-试验阳性的78株金黄色葡萄球菌和205株凝固酶阴性葡萄球菌同时复苏, 其中14株D-试验阳性凝固酶阴性葡萄球菌保存过程中死亡, 故实际检测D-试验阳性菌株为269株。D-试验阴性金黄色葡萄球菌25株、凝固酶阴性葡萄球菌25株。复苏后的菌株用VITEK-2 compact重新鉴定, 重做D-试验。

2. D-试验 用生理盐水将葡萄球菌调为0.5麦氏浊度, 用棉拭子均匀涂布于MH平板, 贴上红霉素和克林霉素纸片, 纸片间距为15~25 mm, 35 ℃ 24 h观察结果。判断标准:克林霉素抑菌圈显示D型, D型环内无菌生长或靠红霉素纸片一侧有小菌落生长为D-试验阳性[6]。

3.MIC测定 用生理盐水将葡萄球菌调为0.5麦氏浊度, 取其100 μ L加入到10 mL阳离子调节MH肉汤中, 再取100 μ L肉汤于MIC板孔内, 35 ℃ 24 h观察结果, 联合孔内有菌生长为诱导试验阳性。

结 果
一、D-试验复测结果

见表1。

表1 不同表型葡萄球菌D-试验的复测结果
二、269株D-试验阳性葡萄球菌单种药物MIC测定结果

红霉素耐药(MIC≥ 8 μ g/mL) 269株; 克林霉素中介(MIC=2 μ g/mL)7株、敏感(MIC ≤ 0.5 μ g/mL)262株, 其中4株纸片法克林霉素敏感而MIC为中介。

三、269株D-试验阳性葡萄球菌联合孔MIC测定结果

按照MIC测定的操作与结果判断, 由红霉素和克林霉素联合诱导耐药试验结果见表2。

表2 红霉素和克林霉素联合检测诱导葡萄球菌耐药试验结果(%)
讨 论

已知克林霉素有极好的组织渗透性, 临床广泛应用于治疗葡萄球菌引起皮肤、软组织的严重感染[7], 但克林霉素耐药形势不容乐观。2005年我国多家医院联合调查葡萄球菌对克林霉素的耐药率, 金黄色葡萄球菌为39.3%, 凝固酶阴性葡萄球菌为14.2%[8], 而低水平红霉素又是大环内酯类-林可霉素-链阳菌素B(MLSB)诱导耐药最有效的诱导剂[9], 可使克林霉素的耐药率进一步升高。

本研究结果提示, 红霉素/克林霉素联合浓度为4/0.5、6/1、8/1.5 μ g/mL的金黄色葡萄球菌、联合浓度为4/0.5、8/1.5 μ g/mL的凝固酶阴性葡萄球菌, 微量肉汤稀释法与D-试验结果完全一致。当联合浓度为0.5/2 μ g/mL时, 稀释法与D-试验的符合率相对较低。尽管2008年CLSI只推荐红霉素/克林霉素(4/0.5 μ g/mL)用于葡萄球菌的诱导克林霉素耐药试验, 但我们试验的结果与Swenson等[4]的结果基本一致, 红霉素/克林霉素(6/1、8/1.5 μ g/mL)也适用于此类试验。建议自动化仪器可设置这3种浓度检测诱导试验, 这样也可校正单个孔引起的试验误差。

微量肉汤稀释法检测葡萄球菌的诱导试验受恒温时间的限制, 6.0%(16/269)的菌株在18 h报告时会出现假阴性结果。CLSI在葡萄球菌诱导试验中有注释, 采用克林霉素治疗诱导试验阳性菌株在某些患者中仍然有效[5], 也有治疗成功的报道[10], 如本研究中发现2株克林霉素MIC为2 μ g/mL的凝固酶阴性葡萄球菌, 在联合浓度为6/1 μ g/mL时诱导试验阴性, 与D-试验不符, 需进一步检测是否携带erm基因。总之, 细菌的耐药性研究随细菌不同而不同, 有待不断深入研究。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] Fiebelkorn KR, Crawford SA, McElmeel MJ, et al. Practical disk diffusion method for detection of inducible clindamycin resistance in Staphylococcus aureus and coagulase-negative Staphylococci[J]. J Clin Microbiol, 2003, 41(10): 4740-4744. [本文引用:1]
[2] National Committee for Clinical Laboratory Stand ards. Performance stand ards for antimicrobial susceptibility testing: 12th informational supplement[S]. M100-S14, NCCLS, 2004. [本文引用:1]
[3] Siberry GK, Tekle T, Carroll K, et al. Failure of clin-damycin treatment of methicillin-resistant Staphylococcus aureus expressing inducible clindamycin resistance in vitro[J]. Clin Infect Dis, 2003, 37(9): 1257-1260. [本文引用:1]
[4] Swenson JM, Brasso WB, Ferraro MJ, et al. Detection of inducible clindamycin resistance in Staphylococci by broth microdilution using erythromycin-clindamycin combination wells[J]. J Clin Microbiol, 2007, 45(12): 3954-3957. [本文引用:2]
[5] Clinical and Laboratory Stand ards Institute/NCCLS. Performance stand ards for antimicrobial susceptibility testing: 18th ed[S]. M100-S18, CLSI, 2008. [本文引用:2]
[6] Steward CD, Raney PM, Morrell AK, et al. Testing for induction of clindamycin resistance in erythromycin-resistant isolates of Staphylococcus aureus[J]. J Clin Microbiol, 2005, 43(4): 1716-1721. [本文引用:1]
[7] Kasten MJ. Clindamycin, metronidazole, and chloramphenicol[J]. Mayo Clin Proc, 1999 , 74(8): 825-833. [本文引用:1]
[8] 王辉, 孙宝莉, 陈民均, 等. 2005年我国5家教学医院革兰阳性球菌耐药监测研究[J]. 中华检验医学杂志, 2005, 29(10): 873-877. [本文引用:1]
[9] Weisblum B, Demohn V. Erythromycin-inducible resistance in Staphylococcus aureus: survey of antibiotic classes involved[J]. J Bacteriol, 1969, 98(2): 447-452. [本文引用:1]
[10] Drnkovic D, Fuller ER, Shore KP, et al. Clindamycin treatment of Staphylococcus aureus expressing inducible clindamycin resistance[J]. J Antimicrob Chemother, 2001, 48(2): 315-316. [本文引用:1]