引用本文
李轶, 周绪华, 冯羡菊. 大肠埃希菌中质粒AmpC酶的流行分布. 2009, 24(8): 595-597
LI Yi, ZHOU Xuhua, FENG Xianju. Distribution of plasmid-mediated AmpC beta-lactamase in Escherichia coli . Labratory Medicine, 2009, 24(8): 595-597  
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《检验医学》编辑部
大肠埃希菌中质粒AmpC酶的流行分布
李轶1, 周绪华1, 冯羡菊2
1.河南省人民医院检验科,河南 郑州 450003
2.郑州大学第一附属医院检验科,河南 郑州 450003

作者简介:李 轶,男,1972年生,硕士,主管技师,主要从事临床微生物检验及细菌耐药机制研究。

通讯作者:冯羡菊,联系电话:0371-66913131。

基金:河南省医学科技攻关项目(200703033)
摘要
目的

了解河南地区大肠埃希菌中质粒AmpC酶的流行分布及其基因特征。

方法

对380株大肠埃希菌进行AmpC酶表型筛选,对筛选阳性株进行多重聚合酶链反应(PCR)及型特异PCR、克隆、测序;等电聚焦电泳检测细菌β-内酰胺酶等电点;接合实验验证质粒传递性;肠杆菌科基因组内重复一致序列(ERIC-2) PCR检测同源性。

结果

380株大肠埃希菌中2.1% (8株)的细菌产AmpC酶,经测序证实均为DHA-1型质粒AmpC酶基因,ERIC-2 PCR结果显示质粒AmpC酶主要以非克隆传播为主。

结论

河南地区发现DHA-1型质粒AmpC酶以非克隆传播为主。

关键词: DHA-1; 质粒; AmpC酶; 大肠埃希菌
中图分类号:R378.2 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2009)08-0595-03
Distribution of plasmid-mediated AmpC beta-lactamase in Escherichia coli
LI Yi1, ZHOU Xuhua1, FENG Xianju2
1.Department of Clinical Laboratory, Henan Provincial People's Hospital, Henan Zhengzhou 450003, China
2.Department of Clinical Laboratory, the First Hospital Affiliated to Zhengzhou University, Henan Zhengzhou 450003,China
Abstract
Objective

To investigate the genotype and distribution of plasmid-mediated AmpC β-lactamases in Escherichia coli in Henan.

Methods

380 Escherichia coli were detected by standard disc diffusion method which was used as screen test for AmpC β-lactamase. Multiplex polymerase chain reaction (PCR), type-specific PCR, clone, sequencing, isoelectric focusing analysis, conjugation and enterobacterial repetitive intergenic consensus-2 (ERIC-2) PCR were performed on positive strains to determine the genotype, the isoelectric point, the transitivity of plasmid and the homology of AmpC β-lactamases.

Results

8 of 380 Escherichia coli strains (2.1%) were AmpC β-lactamases-positive strains. All of them were blaDHA which were confirmed by sequencing. The results of ERIC-2 PCR analysis indicated that the prevalences of plasmid-mediated AmpC β-lactamase were not due to epidemic strains.

Conclusions

The clinical isolate of Escherichia coli producing DHA-1 type plasmid-mediated AmpC β-lactamase was found in Henan. The prevalence were not due to epidemic strains.

Keyword: DHA-1; Plasmid; AmpC β-lactamase; Escherichia coli

AmpC酶是革兰阴性杆菌产生的最重要的β -内酰胺酶之一, 从1989年Bauernfeind等[1]报道CMY-1型质粒AmpC酶以来, 新的质粒AmpC酶基因在世界各地不断被发现, 近年来成为了临床微生物关注的热点, 大多数研究集中在流行病学、分子生物学、检测方法和耐药特性与治疗上。为掌握质粒AmpC酶在本地区的流行及基因型情况, 我们对380株临床分离的大肠埃希菌进行了研究。

材料和方法
一、材料

1. 菌株 收集2006至2007年河南省人民医院及郑州大学第一附属医院临床分离的大肠埃希菌380株, 菌株来自痰、脓、血等标本, 无重复株。产CMY-2质粒AmpC酶的阳性株为ampC基因检测对照株; TEM-12、TEM-10、TEM-28、SHV-1、ACT-1为等电聚焦电泳(IEF)对照株; 大肠埃希菌(ATCC 25922)为质控株。所有菌种均用BD凤凰-100全自动细菌鉴定仪鉴定到种。

2. 主要试剂 药敏纸片均购自Oxiod公司; 培养基均购自郑州安图绿科生物工程有限公司; 质粒DNA提取试剂盒和聚合酶链反应(PCR)扩增试剂盒均为上海鼎安生物科技有限公司产品。

3. 仪器 凤凰-100全自动微生物鉴定药敏系统购自美国BD公司; IEF仪及试剂购自安马西亚公司; Mastercycler 5330型PCR 仪购自德国Eppendorf公司。

二、方法

1. 表型筛选 凡纸片扩散法头孢西丁(FOX)≤ 18 mm, 即认为是AmpC酶筛选阳性。

2. 多重PCR 根据质粒ampC基因的分群, 设计具有群特异性的6对引物[2]

3. β -内酰胺酶基因扩增及测序 按文献[3~5]进行, 筛选β -内酰胺酶基因的引物序列见表1, 用表2引物扩增后测序。

表1 PCR引物序列及扩增片段长度
表2 全序列扩增及测序引物

4. 接合试验 参照文献[6]进行, 以多重PCR中筛选出来的DHA来源菌株作为供体菌, 耐利福平的大肠埃希菌C600为受体菌, 培养至对数期后等量混匀, 接种至含100 μ g/mL利福平、10 μ g/mL头孢噻肟的麦康凯培养基上, 过夜培养, 不利用乳糖的菌落才是接合子, 对所有接合子用多重PCR确认是否含有质粒ampC基因。

5. IEF 按操作说明书进行IEF, 电泳完毕, 用0.5 mg/mL头孢硝噻吩显色。抑制试验:分别用0.5 mg/mL头孢硝噻吩加与不加0.3 mol/L氯唑西林或克拉维酸进行显色。

6. 肠杆菌科因组内重复一致序列(ERIC-2) PCR 用ERIC-2引物进行随机扩增多态性DNA分析。2条带以上的差别被认为是有意义的。

结 果
一、表型检测及多重PCR结果

380株大肠埃希菌中, FOX≤ 18 mm 71株, 其中8株在多重PCR中出现了405 bp条带(DHA群), 阳性率为2.1%。8株细菌均对氨苄西林、氨苄西林-舒巴坦、头孢唑啉、头孢噻肟及头孢他啶耐药; 同时均对亚胺培南、美罗培南敏感; 3株耐头孢吡肟、5株敏感; 2株耐头孢哌酮-舒巴坦, 6株敏感。

二、DHA-1型ampC基因的检测

经PCR扩增、测序和Blast比对, 所检测到的质粒ampC基因均为DHA-1型。

三、接合实验

有2株细菌接合实验阳性, 经PCR证实基因blaDHA-1被传递。

四、IEF

8株大肠埃希菌及2株接合子均产生等电点(pI)为7.8的β -内酰胺酶, 该酶受氯唑西林抑制而不受克拉维酸抑制; 8株细菌还同时产生pI 5.4的β -内酰胺酶, 该酶受克拉维酸抑制而不受氯唑西林抑制; 部分菌株还产生pI 8.1左右的β -内酰胺酶。

五、β -内酰胺酶基因检测

8株细菌均携带blaDHA-1和blaTEM-1, 其中有3株同时携带blaSHV-12; 3株携带blaCTX-M-14; 1株同时携带blaCTX-M-14和blaSHV-12。

六、ERIC-2 PCR结果

见图1。1、3泳道为同一克隆, 4、6泳道为同一克隆, 其他泳道各不相同, 其中4、6泳道菌株来自同一科室, 而1、3泳道菌株来自不同科室, 显示产质粒AmpC酶的大肠埃希菌以非克隆传播为主。

图1 产DHA-1大肠埃希菌的ERIC-2 PCR结果

讨 论

质粒AmpC酶主要在大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌等肠杆菌科细菌中产生, 我国及亚洲地区质粒AmpC酶的流行主要以DHA-1型为主, 也有报道ACT-1和CMY-2, 本研究中发现的质粒AmpC酶均为DHA-1型, 再次证实了这一流行情况。本研究中, 质粒AmpC酶的发生率只有2.1%, 且以非克隆传播为主, 和国内其他研究情况类似。质粒AmpC酶和超广谱β -内酰胺酶(ESBLs)同样是质粒介导的β -内酰胺酶, 同时发现于上世纪80

年代, 到目前ESBLs的发生率已经> 30%, 而质粒AmpC酶的发生率一直保持在10%以下, 其传播以非克隆为主, 未出现类似于ESBLs一样的耐药基因在不同DNA之间的频繁转移。为什么2种质粒介导β -内酰胺酶基因的传递有如此大的区别?除了整合子的解释外, 其他原因值得我们关注, 继续深入的研究将帮助我们控制耐药性的广泛传播。

质粒AmpC酶常和ESBLs等其他β -内酰胺酶同时产生, 增加了临床用药的难度, 如果质粒AmpC酶获得类似于ESBLs的传递方式, 将使临床可用药物的选择进行性减少。因为细菌对FOX耐药有多种机制, FOX纸片法只能作为初步筛选使用, 而三维试验或乙二胺四乙酸(EDTA)法等表型试验均不能区分染色体AmpC酶和质粒AmpC酶, 所以建立一种简便的检测方法及时检测出质粒AmpC酶, 以便及时采取有效措施预防耐药性的产生、传播, 并指导临床用药, 是临床微生物工作者不得不面临的一个难题。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] Bauernfeind A, Chong Y, Schweighart S. Extended broad spectrum beta-lactamase in Klebsiella pneumoniae including resistance to cephamycins[J]. Infection, 1989, 17(5): 316-321. [本文引用:1]
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[3] Schlesinger J, Navon-Venezia S, Chmelnitsky I, et al. Extended-spectrum beta-lactamases among Enterobacter isolates obtained in Tel Aviv, Israel[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2005, 49(3): 1150-1156. [本文引用:1]
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[6] 李轶, 蒋燕群, 汤瑾, 等. 大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌中质粒AmpC酶的流行分布[J]. 检验医学, 2006, 21(5): 517-520. [本文引用:1]