引用本文
李百文, 倪培华, 诸琦, 徐洪. 三元复合因子Net基因的克隆及其真核表达. 2009, 24(6): 423-427
LI Baiwen, NI Peihua, ZHU Qi, XU Hong. Clone of ternary complex factor Net cDNA and analysis its expression and function. Labratory Medicine, 2009, 24(6): 423-427  
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《检验医学》编辑部
三元复合因子Net基因的克隆及其真核表达
李百文1, 倪培华2, 诸琦1, 徐洪3
1.上海交通大学医学院附属瑞金医院消化内科,上海 200025
2.上海交通大学医学院附属瑞金医院检验系,上海 200025
3.上海交通大学医学院基础医学院生物化学教研室,上海 200025

作者简介:李百文,男,1976年生,博士,主治医师,主要从事消化系统疾病研究。

通讯作者:诸 琦,联系电话:021-64370045。

基金:上海市教委基金项目(05B240)
摘要
目的

克隆人Net基因,构建Net 基因表达载体并诱导融合蛋白表达。

方法

从正常人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中抽提总RNA,经逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出人全长Net cDNA,构建pEGFP-N1/Net 重组体质粒,并将其转染入高表达原癌基因 c-fos 的人胰腺癌细胞 PANC-1中,分析转染细胞的Net表达水平和对细胞增殖力的影响。

结果

从人胰腺癌细胞PANC-1中克隆出长约1 224 bp 的Net基因目的片段,成功构建了重组质粒pEGFP-N1/ Net,诱导表达目的蛋白后,Net 抑制原癌基因 c-fos 的表达,进而抑制人胰腺癌细胞的增殖。

结论

构建重组质粒pEGFP-N1/Net 并表达Net 融合蛋白,其抑制了细胞的增殖,为进一步研究Net 的各种生物学活性及作用机制奠定了基础。

关键词: Net; 克隆; 融合蛋白
中图分类号:Q78 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2009)06-0423-05
Clone of ternary complex factor Net cDNA and analysis its expression and function
LI Baiwen1, NI Peihua2, ZHU Qi1, XU Hong3
1.Department of Gastroenterology, Ruijin hospital, Medical School of Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200025, China
2. Faculty of Medical Laboratory, Ruijin hospital, Medical School of Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200025, China
3. Department of Biochemistry, Medical School of Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200025, China
Abstract
Objective

To clone human ternary complex factor Net gene , construct the recombinant expression plasmid pEGFP-N1/ Net and express the fusion protein.

Methods

The Net gene was amplified by RT-PCR from the total RNA extracted from human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). The amplified product was inserted into the pEGFP-N1 plasmid vector which expressed the green fluorescence protein (GFP). Then the recombinant plasmid p EGFP-N1/ Net was transfected into the human pancreatic carcinoma cell PANC-1 which over-expressed c-fos protein, and we analysed the expression of c-fos and the proliferative ability of recombinant cells.

Results

Net gene with a reading frame of 1224 bp was successfully cloned from HUVEC, which inhibits the expression of c-fos and proliferation of PANC-1 cells.

Conclusions

Human ternary complex factor Net gene was successfully cloned and constructed pEGFP-N1/Net plasmid. The prepared fusion protein lays the basis for further study the biological activities of Net.

Keyword: Net; Clone; fusion protein

Net 基因是三元复合转录因子 (the ternary complex factors, TCFs)家族中的一个成员, 其能够与血清反应因子 (serum response factor, SRF) 相互作用于原癌基因c-fos启动子上的血清反应元件 (serum response element, SRE), 共同结合形成复合体, 进而调节c-fos基因的转录和表达[1]。现已明确, 正常状态下Net是一个重要的转录抑制因子, 其功能改变可能和多种肿瘤发生相关。我们拟克隆人 Net基因, 构建pEGFP-N1/ Net重组表达质粒并转染人胰腺癌细胞 PANC-1中, 分析转染后细胞的 Net 转录和翻译水平、c-fos 表达变化和细胞增殖力

材料和方法
一、材料

1.主要材料 人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)和人胰腺癌 PANC-1 细胞株购自ATCC 公司, 大肠杆菌DH-5α 、pEGFP-N1 质粒由本室保存。

2.主要试剂 Kpn I、Xho I限制性内切酶、T4 DNA连接酶、PCR试剂为Takara公司; 逆转录试剂Superstcript、脂质体lipofectamine 2000、G 418为 Invetrogen公司; DNA 凝胶回收、质粒提取试剂盒为Qiagen公司; 兔抗人c-fos抗体为Sigma 公司, 羊抗人Net抗体为Santa Cluze公司; 辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔及驴抗羊抗体为上海康成公司; DMEM 、1640细胞培养基、胎牛血清、Trizol RNA 抽提试剂为Gibco公司; 增强化学发光试剂(enhanced chemiluminecence, ECL)为Amersham公司; 引物由上海生物工程有限公司合成。

二、方法

1.pEGFP-N1/Net 重组质粒的构建 (1)总RNA 提取、cDNA 合成、全长Net 的PCR 扩增:HUVEC 细胞在含10 %胎牛血清(FBS)的 1640 培养基中, 37 ℃、5%CO2 的条件下培养1周后, 用Trizol 试剂提取总RNA, 逆转录合成cDNA。根据GenBank 公布的人类Net 完整mRNA 序列NM_005230, 设计引物, 并在上下游引物的5'端分别加上Xho I 和 KpnⅠ 的限制性内切酶位点, 引物1 5'-GATCTCGAGATGGAGAGTGCAATCACGCT-3', 引物2 5'-GAGGGTACCGGATTTCTGAGAGTTTGAAGA-3', 在Taq 酶的作用下, 经94 ℃ 1 min预变性, 94 ℃ 40 s, 55 ℃ 40 s, 72 ℃ 90s, 35个循环, 72 ℃延伸5 min, 扩增的目的条带长度应为1 224 bp ; (2)酶切、连接、鉴定:将带有绿色荧光蛋白报告基因的pEGFP-N1 空载质粒与纯化后的PCR 产物分别进行Kpn Ⅰ 和 Xho I的双酶切, 酶切产物经电泳纯化并回收后, Net 基因片段和pEGFP-N1 载体片段以1~10:1 摩尔比例, 在T4DNA 连接酶的作用下, 置16 ℃过夜进行连接反应。将连接产物转化感受态大肠杆菌 DH5α , 在含有终浓度为30 μ g/ mL卡那霉素的LB 固体培养基上生长。挑取单个菌落入LB 液体培养基, 置37 ℃过夜, 提取重组质粒以Kpn Ⅰ 和Xho I 酶切鉴定, 并送上海英骏生物工程有限公司测序。重组质粒命名为pEGFP-N1/ Net。

2. pGFP-N1/ Net 转染 PANC-1 细胞 PANC-1 细胞以105个/孔的密度铺6 孔板上, 每孔各加3 mL含10 %FBS 的 DMEM 培养基, 37 ℃、5 % CO2 的条件下培养24 h , 待细胞铺满50%~80 %后, 以脂质体转染的方法将pEGFP-N1/ Net 重组质粒和 pEGFP-N1 空载质粒分别转染入PANC-1 细胞, 转染效率约为50%~60%。因为载体为表达绿色荧光蛋白的pEGFP-N1 质粒, 转染细胞培养48 h 后, 以未转染的纯PANC-1 细胞为对照, 在荧光显微镜下观察绿色荧光表达情况。转染96 h 后, 无转染纯PANC-1 细胞对照组、空载质粒pEGFP-N1 转染细胞组和重组质粒p EGFP-N1/ Net 转染细胞组, 分别以1:1 传代, G 418筛选浓度为800 μ g/ mL , 挑选抗性细胞克隆种入96孔板中, 挑取单克隆集落逐步扩增后传代培养, 以200 μ g/ mL G 418 维持。

3. 转染细胞中Net及c-fos 表达水平的 RT-PCR 相对定量分析 上述3 组细胞分别提取总RNA, 以β -actin 为内参照, 进行Net 和c-fos 的RT-PCR 分析。PCR 扩增反应条件:94 ℃预变性4 min, 94 ℃ 40 s, 55 ℃ 40 s, 72 ℃ 90 s, 35 个循环后72 ℃延伸10 min。引物序列见表1。10 μ L PCR 扩增产物经12 g/L 琼脂糖(含溴乙锭5 μ g/mL) 电泳, 通过图像分析软件(上海天能科技有限公司)读取目的电泳条带的斑点密度扫描值, 将Net、c-fos 条带与β -actin 条带的比值作为Net和c-fos 表达的相对量, 并进行统计分析。

表1 PCR 引物

4.Net 及 c-fos 蛋白表达检测 使用蛋白提取液(radio immunoprecipitation assay, RIPA)分别提取上述3 组细胞的总蛋白, BCA法测定蛋白浓度。取等量蛋白上样于9 %聚丙烯酰胺凝胶进行电泳, 继而转移蛋白于硝酸纤维素膜, 膜于5 %脱脂奶粉TBST (Tris-buffered saline Tween-20) 中4 ℃封闭过夜, 加封闭液稀释的一抗(羊抗人Net 抗体, 1:200 或兔抗人 c-fos 抗体, 1:5 000) 过夜, 用TBST洗膜3 次, 加封闭液稀释HRP标记二抗(山羊抗兔抗体或驴抗羊, 1:5 000) 4 ℃过夜, TBST洗膜3 次, 加ECL (Amersham公司) 试剂, X 光胶片曝光, 洗片。

5. MTS 法检测细胞增殖力 上述3 组细胞于对数期分别接种于96 孔板中, 每孔103个细胞, 以培养基为对照组, 37 ℃、5% CO2 的条件下培养24 h 后每孔加入 MTS/PMS 液40 μ L, 继续培养4 h , 酶标仪测定492 nm 处各孔吸光度(A值), 取每孔平均值。计算生长增殖抑制率:生长增殖抑制率= (1-A值实验组/A值对照组)× 100%。

结 果
一、人Net cDNA 的PCR 扩增

从HUVEC 细胞提取的总RNA 经RT-PCR 扩增后, 其扩增产物在10g/L的琼脂糖凝胶电泳显示出 1 条约1 224 bp 的亮带, 符合预期结果(见图1)。

图1 人全长Net 基因的PCR扩增注:1为PCR扩增产物1; 2为PCR扩增产物2

二、重组质粒的Xho I 和KpnⅠ 酶切鉴定

我们选用的pEGFP-N1 质粒长度为4 700 bp, Net cDNA 的PCR 扩增产物约为1 224 bp , 因此重组质粒经Xho I和Kpn Ⅰ 双酶切后电泳应在约4 700 bp位置和1 224 bp 位置各有1 条带, 完全符合预期结果(见图2) 。

图2 Net重组质粒的酶切鉴定注:pEGFP-N1为空载体质粒克隆; Net1为质粒克隆1; Net2为质粒克隆2; Net3为质粒克隆3

三、pEGFP-N1/ Net重组质粒在PANC-1细胞中表达

pEGFP-N1 载体在其多克隆位点后带有绿色荧光蛋白报告基因。通过脂质体转染方式将pEGFP-N1 和pEGFP-N1/ Net 重组质粒转染入PANC-1 细胞48h 后, 在荧光显微镜下观察到了细胞中绿色荧光蛋白的表达(见图3)。

图3 pEGFP-N1/Net 重组质粒在PANC-1中的表达

四、转染细胞中Net及c-fos表达水平的RT-PCR相对定量分析

质粒转染筛选成功后, 上述3组细胞分别进行RT-PCR检测(见图4)。以β -actin 为对照电泳条带, 经斑点密度扫描分析后的统计结果显示, 纯PANC-1 细胞组、pEGFP-N1 细胞组以及pEGFP-N1/Net质粒转染细胞组的Net mRNA 相对表达量分别为0.733± 0.036、0.749± 0.038、1.06± 0.082; c-fos mRNA相对表达量分别为0.941± 0.142、0.973± 0.118、0.505± 0.128。统计分析表明, 较之纯PANC-1细胞和pEGFP-N1细胞, 转染了重组质粒的p EGFP-N1/Net细胞的Net mRNA相对表达明显上升, c-fos表达明显下降, 差异均有统计学意义(P< 0.01)。

图4 各组细胞中Net、c-fos mRNA的表达注:1为PANC-1细胞组; 2为pEGFP-N1空载体转染组; 3为pEGFP-N1/Net质粒转染组; a为Net mRNA表达水平; b为c-fos mRNA表达水平

五、Net及c-fos蛋白表达检测

将曝光后的X光胶片通过图像分析软件读取目的条带激光吸光度扫描值, 以各组β -actin 条带的扫描值标化其相应组的Net及c-fos蛋白表达量(见图5)。稳定转染后Net蛋白表达明显增高(P< 0.01), c-fos 蛋白表达明显降低(P< 0.01)。而空白对照组以及空质粒转染组则差异无统计学意义(P> 0.05) 。

图5 Net 及 c-fos 蛋白在各组中表达变化

六、MTS法检测细胞增殖力

与空质粒pEGFP-N1 转染组细胞和空白对照组PANC-1 细胞相比, , 重组质粒pEGFP-N1/ Net 转染组细胞较少。MTS 分析显示, 以PANC-1 细胞组生长率为1, pEGFP-N1 转染组为0.982± 0.105%, pEGFP-N1/ Net 转染组为0.38± 0.102%, pEGFP-N1/Net 转染组细胞的生长率与其他2组比较明显下降, 差异有统计学意义(P< 0.01); p EGFP-N1 转染组 与PANC-1 细胞组间差异无统计学意义(P> 0.05) 。可以认为Net 降低了PANC-1 细胞的增殖(见图6) 。

图6 各组细胞的生长率的比较

讨 论

Net基因是TCFs家族中的一个重要成员, 同属于这一家族的还有ELK-1和Sap-1[2, 3], 他们共同的特点就是能够与SRF及原癌基因c-fos启动子上的SRE共同作用形成三元复合转录体, 进而调节原癌基因c-fos的转录[1]。Net与TCFs家族中另2名成员相似, 目前研究所知, 他们拥有部分相同的结构域:从N端至C端依次为A结构域(与Ets DNA结合), B结构域(与SRF结合), D盒[为丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)激酶锚定作用位点]和C结构域(被MAPK信号通路磷酸化激活后, 活化目的基因转录)[1, 4]。当然, Net基因在结构上也存在着自己独特的特点, 在B和D结构域之间, Net拥有2个相互独立的抑制结构域, 即NID(the net inhibitory domain)和CID(C-terminal binding protein inhibitory domain)[5], 二者与Net正常情况下自主抑制功能密切相关。虽然他们具有相似的结构域, 但在转录调节上的作用 Net 却与另外2名成员不同, 在生理状态下, Net对靶基因 c-fos 的转录起明显抑制作用, 但当外界刺激通过Ras-MAPKs信号转导通路转导后, 则可能使 Net 失去有效的抑制功能, 原癌基因 c-fos 则可迅速启动转录, 促进细胞无限制增殖[6]。

由于Net对原癌基因c-fos转录的抑制作用, 而c-fos又被证实与多种肿瘤的发生密切相关[7], 故我们预测Net基因可能作为一种潜在的抑癌基因而在肿瘤发生中发挥着重要作用。为了更好地了解Net基因在肿瘤发生中的相关功能和生物学特性, 我们构建了 Net 真核表达载体即 pEGFP-N1/ Net 重组质粒, 将其转染入人胰腺癌细胞PANC-1 后, 可以看到载体上带有的绿色荧光蛋白顺利表达, 随后的RT-PCR 和Western blot 分析也证实细胞中Net 基因的转录及翻译水平明显高于未转染细胞, , 这说明我们成功构建了Net 真核表达系统。

经RT-PCR 和Western blot 分析证实, 本实验所选用的PANC-1 细胞是高表达c-fos 蛋白的人胰腺癌细胞。c-fos 是转录激活因子激活蛋白-1中的最重要组成成员之一, 其与细胞的增殖、分化和肿瘤形成密切相关[7]。生理状态下c-fos的转录是被严格控制的, 而其不适当的表达则可引起细胞表型的改变[8]。以往研究亦证实c-fos 是与胰腺癌高度相关的一个原癌基因[9, 10] 。而我们的研究发现, 转染了野生型Net 的PANC-1 细胞中c-fos 的转录水平明显低于未转染细胞, 这说明Net 可以直接或间接抑制c-fos 表达。在进一步分析重组细胞的增殖能力后发现, 转染了野生型Net 的PANC-1 细胞增殖率较未转染PANC-1 细胞明显下降。可以假设, Net 基因在PANC-1 细胞中的过表达抑制了原癌基因 c-fos 的转录和激活, 进而抑制了转录激活因子激活蛋白-1的活性, 其可能进一步纠正了细胞周期素、细胞周期素依赖性激酶或细胞周期素依赖性激酶抑制因子等对细胞周期的影响, 从而实现抑制细胞周期的进程。

作为一个潜在的肿瘤抑制因子, Net 在肿瘤中的作用机制越来越受到人们的重视, 我们此次构建pEGFP-N1/ Net 重组质粒真核表达载体, 并初步研究了Net 对胰腺癌细胞的生物学影响, 为进一步研究Net 基因在各种疾病中的生物学功能奠定了物质基础的同时, 也初步探讨其作为一种肿瘤治疗基因的可能性。

The authors have declared that no competing interests exist.

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