在分子生物学技术出现之前, 人们长期采用病原菌的生理、生化特点进行菌株分型。主要有生物亚种(株)、血清型、噬菌体型、短杆菌素型和抗菌药物耐受谱型。

在食品和环境卫生检测时, 为了确定环境菌株的来源, 比较简单和传统的方法是指示细菌培养法, 如总大肠菌群数、粪大肠菌群、大肠杆菌数和肠球菌等。这些指示菌具有能够快速培养计数、非病原性, 且同所关注的研究病原菌对象具有相似的生存特征。在世界很多国家应用较多的是粪大肠杆菌/粪链球菌指数(Fecal coliform/Fecal streptococci, FC/FS)。当FC/FS> 4时, 提示来源于人源污染; 间于0.1~0.6时, 为家养畜禽污染; 而< 0.1时, 为野生动物污染^[1]。现在美国公共卫生协会已不再推荐此方法^[2]。

在临床医学中, 传统的菌株分型方法有菌株的生理、生化特征, 如对不同糖类的分解性, 产生特异的生化反应使得底物变色, 或者对环境条件的耐受性, 现在已经被广泛使用的VITEK、DADE和ATP等细菌自动化鉴定仪所替代。更为常见和有用的是采用微量稀释肉汤法、纸片法、固体培养技术系列稀释法或T实验法等测定分离菌株的耐药谱。还有一种较为常用的方法是采用特异的血清, 直接凝集试验将临床分离菌株分为不同的血清型。血清学分型是根据细菌的菌体抗原(O抗原)、鞭毛抗原(H抗原)及荚膜抗原(K抗原)对细菌进行分型的。

基于外在表型的分型技术在临床上应用广泛, 使其具有十分重要的作用, 但区分度低、重复性差、标准型难仍是其制约因素。

在过去的20多年的研究过程中, 分子生物学在病原菌分型上得到了广泛应用。如凝胶脉冲电泳技术(pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)、限制性内切酶技术、质粒DNA图谱分析、基于聚合酶链反应(PCR)和基因测序(如SLST— — 单一位点测序分型, MLST— — 多位点测序分型)的分型技术, 尤其后者发展最为迅速。重复序列引物PCR(repetitive element PCR, Rep-PCR)指纹法、限制性内切酶长度多态(RFLP)分析法、l6SrDNA序列分析法在生物多样性研究、菌种鉴定、疑微生物资源的开发中得到广泛应用, 但最高分辨能力及适用性各不相同。

1. PFGE PFGE通过采用酶切位点少的内切酶剪切基因组, 而后用特殊的电泳方法进行片段的有效分离, 使得长达1 000 kp的大片段DNA也能得到分离。电泳时主要应用箝位匀强电场系统(contour -clamped homogenous electric field, CHEF)和场反转凝胶电泳(field inversion gel electrophoresis)^[3]。在凝胶上反映的片段形式将在一定程度上反映遗传物质的改变状况, 如那些改变酶切位点的点突变和插入或剪除的片段。Tenover等^[4]提出了解析这些酶切图谱的准则, 当酶切片段差异< 3条时, 遗传事件的差异< 1个; 差异片段在4~6时, 遗传事件的差异可能为2个; > 7条时, 遗传事件的差异为3个, 如此等等。某些研究指出在大多菌株中当发生1个差异事件时, 菌株的进化时间约为3个月。PFGE分析软件有BioNumerics、GelCompar 、Molecular Analyst Fingerprinting、BioImage和手工分析等, 而后以树状图的形式体现菌株之间的进化关系。特点为重复性好、分辨率高。现已有超过40余种的病原菌进行过PFGE分析。PFGE已经为美国国家食源疾病调查网-PulseNet 分析大肠埃希菌(0157:H7), 公共健康实验室解析非典型沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌的院内感染问题。有的学者通过比较研究, 指出PFGE的分辨率高于核糖体谱型和随机引物扩增片段(RAPD), 且当采用1个内切酶的分辨率不佳时, 可以采用2种内切酶加以提高^[5]。但PFGE的缺点在于时间长, 费用高, 需要特殊的仪器和受过专门训练的人员操作。

2. 变性凝胶电泳(denaturing-gradient gel electrophoresis, DGGE) DGGE是对电泳技术的改良。通过在凝胶中加入梯度变性剂, 使双链DNA在电泳过程中停止于相当于熔点温度的凝胶位置, 这样基因中碱基的点突变导致的熔点温度的改变, 就可以体现为DNA在凝胶上位置的变化。当PCR与DGGE联用时, 分析菌株的rDNA或大肠埃希菌特定的uidA基因, 可以较好地对菌株进行分型^[6]。DGGE还处在发展的初期, 需要积累更多的数据, 同PFGE一样需要特殊的仪器和相应的专业人士进行操作。

3. 质粒DNA图谱分型技术 质粒图谱分析是最早应用于流行病学的分子分型方法。这种方法是根据质粒的数量和大小来绘制图谱从而对不同菌株进行分型的。在菌株中携带的质粒越多则质粒图谱分析作为一种流行病学分型方法的特异性越好。质粒图谱分析的优点是操作相对简单, 只需要简单的设备就可以完成, 得到结果迅速, 费用低廉。但质粒图谱分析有一难以克服的缺陷在于质粒可以自发的丢失、获得及在同种细菌甚至是在异种细菌之间的转移, 这就造成了质粒图谱的不稳定性, 同一菌株在不同时期可能会有不同的质粒图谱。其次质粒图谱分析区分流行株和非流行株的能力有限。另外, 质粒图谱分析方法不能区分那些大小相同而DNA 序列不同的质粒^[7]。

4. 核糖体分型 核糖体分型是最早用于病原菌分子分型的技术^[5]。病原菌染色体通过稀有内切酶酶切产物进行凝胶电泳, 而后采用特异性的rRNA引物杂交识别, 确定不同条带模式。此后核糖体谱型还同PCR结合, 对环境和医院分离的细菌进行分型。也可以同PFGE一样采用罕见的内切酶, 片段的检测采用Southern杂交和化学发光或放射性发光的探针技术, 分析 rRNA 的多态性。为了增强方法的区分度, 有学者采用 HindⅢ 、EcoRⅠ 、SalⅠ 和BglⅠ 等4种内切酶切割基因组。美国Qualicon 公司已开发出RiboPrinter微生物分型系统^[8]。此种方法的特点在于自动化程度高, 但对菌株基因组中微小差异的区分度有限, 限制了该方法的应用。

5. 扩增片段长度多态(amplified fragment length polymorphism, AFLP) AFLP结合了RFLP技术和PCR。一般采用2种内切酶, 其中1个的酶切位点较多。酶切后, 采用加接头的随机引物进行PCR扩增。产物凝胶电泳后, 采用特异探针杂交检测。而后用BioNumerics等软件分析杂交结果。AFLP结合了RFLP和PCR技术特点, 具有RFLP技术的可靠性和PCR的高效性, 已在病原菌的分子分型中广泛应用。但该技术已经申请专利保护, 试剂盒费用昂贵, 并对样品DNA质量要求严格, 对某些不引起酶切位点改变的细小碱基序列差异敏感性不强。

6. Rep-PCR Rep-PCR是一种以特异引物扩增细菌基因组中重复出现的片段, 通过对PCR产物电泳结果的比较, 分析菌株间基因组存在的差异。这些重复序列在原核生物界广泛存在, 在一些细菌属和种中是保守的。这种方式获得的光谱带的大小和数量的不同代表着不同菌株重复序列间的距离和重复序列的数量。最初在大肠埃希菌定义了3 种不同的亚单位, 即boxA(57 bp)、boxB(43 bp) 和boxC(50 bp), 而只有boxA 亚单位在不同细菌中表现出多拷贝和高保守性。按照box片段中的boxA 亚单位设计的寡核苷酸引物进行PCR , 使得位于重复序列之间的不同基因区域得以选择性扩增, 得到大小不等的DNA 扩增片段, 通过对PCR 产物进行电泳图谱分析获得分类学信息^[9]。Rep-PCR已经用于医院感染的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、肠沙门菌、黄单胞菌属和肠球菌等的分类和鉴定。Rep-PCR的重复性较差, 且需要细菌培养, 同样仍处于发展的初期, 需要众多数据的累积。

7. 其他PCR 多重PCR(Multiplex PCR)、巢式PCR(Nested PCR)、任意引物PCR(arbitrarily primed PCR, AP-PCR)、可变串联重复数目(variablenumber tandem repeat, VNTR)和间隔区寡核苷酸分型技术虽然各有长处, 如试验简便、程序少、易操作等, 但也存在分辨率低、重复性差、结果解析困难等不足, 因此还未广泛应用于临床。

8. DNA测序技术 随着DNA测序技术的快速发展, 现在分子分型的趋势日益趋向于染色体的单一或多个位点的多态性上。因为基于基因序列分型是在A、T、G和C等4种较为简单编码的基础上进行分析的, 因此可以更好地标准化程序、统一解析技术、方便分类^[10]。发展较快的有2种技术, 其一为单一位点测序分型(single-locus sequence typing, SLST), 这种技术用于分析金黄色葡萄球菌的spa基因的多态性, 该基因在菌株中重复数目多, 间隔序列变化大; 另一为多位点测序分型(multi-locus sequence typing, MLST), MLST技术通过7个或更多保守的管家基因进行测序, 这些区域一般间于400~500 bp长。这种技术最早用于脑膜炎奈瑟球菌的毒株分型。现在已广泛应用于金黄色葡萄球菌、肠球菌和肺炎链球菌等病原菌的分型。虽然目前与全基因组筛查的PFGE等分型技术参比分析时分辨率较低, 但随着位点的进一步优化, 找出那些更能快速反应进化关系的基因, 分辨率将得到极大提高。

许多学者对不同分子分型技术进行了比较。周贤轩等^[11]在对厦门温泉分离到的嗜热菌进行鉴定分析时, 采用了Rep-PCR指纹法、PCR-RFLP分析法、l6SrDNA序列分析法研究菌株的多样性, 结果发现在这3种鉴定方法中, Rep-PCR最简单, 分辨能力最强, 可鉴别16SrDNA序列同源性> 99.5%甚至完全相同的不同菌株; 16SrDNA分析能快速准确地对微生物进行分类鉴定, 其在分类学中的核心地位不可替代。但当l6SrDNA序列同源性> 99.5%时难以获得准确的鉴定结果; PCR-RFLP分析法分辨力弱, 可用于种到属水平的研究。刘元力等^[12]采用RAPD、 PFGE 、AFLP、核酸测序分型(sequence-based typing, SBT)对军团菌进行了分子分型及其流行病学调查, 指出RAPD、 PFGE 、AFLP是目前应用较为广泛的分子指纹技术, 技术成熟, 便于研究者互相交流和比较, 而SBT方法则是近年发展起来的一种新的应用于微生物分型的方法, 具有更为广阔的发展前景。刘佳妍等^[13]的研究表明, 虽然有时Rep-PCR分辨力稍低, 但与PFGE获得的结果确有很好的关联度。Navia等^[14]比较了Rep-PCR和PFGE, 认为两者结果有较好的相关性, 前者相对有效且快捷, 后者虽是金标准, 但费时、费力, 资金投入也很大。Myoda 等^[15]对PFGE、Rep-PCR和核糖体分型等分型方法进行了比较分析, 认为Rep-PCR的高分辨率有赖于良好扩增引物的优化; 而不同的限制性内切酶极大地影响了对后2种技术的鉴别度。

综上所述, 不同的分型方法各有优势。表型变化总是落后于基因型的变化, 逐渐会被分子分型技术所取代。目前以PFGE技术已经成为世界各实验室的主要分型方法。但现在还没有哪种方法能够将重复性、分辨能力、可比性、操作简便和费用低廉等几个方面完美结合在一起。对于大量的样本, 相对简单、较高分辨力、需要专业技术少和较低费用的基于 PCR 的分子分型方法较为适合, 而希望将实验室的数据保留并形成数据库的时候, PFGE 有更大的优势。但是随着基因测序技术的快速发展, 这些都将让位于DNA测序分型技术。