1.显微镜或涂片观察 直接涂片或组织切片法。可用标本有脑脊液、痰液、胸腹水、骨髓、淋巴结、胎盘、脑组织(死胎)等, 标本经吉姆萨染色, 发现弓形虫速殖子或假包囊即可确诊为急性感染; 过碘酸-雪夫染色(PAS)发现弓形虫缓殖子可用于诊断慢性感染^[7]。

2.接种动物或组织培养分离 将患者组织、体液接种无自然感染的健康小鼠腹腔内, 取小鼠腹水涂片或脑组织切片检测。组织培养分离常以孕妇羊水为标本, 培养后用间接免疫荧光试验(IFT)检测弓形虫。

病原学检测时, 由于虫体形态不典型, 应用常规染色方法经常使虫体难以辨认, 检出率较低。为避免漏诊, 对轻度感染常需反复检查。所需标本多通过有创获得, 因此目前临床较少应用。

免疫学检测由于其快速、无创、准确、经济, 已成为现在应用最广、发展最快的检测弓形虫感染的方法, 根据检测物的不同可分为2类:

1.检测抗原 检测对象为宿主细胞内的速殖子、包囊、虫体的代谢产物或裂解产物(一般是循环抗原或循环免疫复合物)。常用方法有酶联免疫吸附试验(ELISA)、生物素-亲和素ELISA(ABC-ELISA)、双夹心ELISA及对流免疫电泳等。血液中的抗原比特异性抗体出现早, 是病原体存在的特征, 检测抗原特异性高。应用ABC-ELISA可检测到的最低浓度为0.075 μ g/mL^[8], 敏感性好。但由于抗原提取困难, 提取方法尚不成熟, 这种方法只在科研中应用, 目前尚无商品试剂盒供应。

2.检测抗体 成人感染弓形虫后7~15 d可检测到IgM、IgG、IgE和IgA抗体。其中IgM是体液免疫反应中最早出现的抗体, IgM抗体阳性提示有近期感染, 特异性IgM抗体阳性滴度达到诊断标准, 可作为急性弓形虫感染的诊断依据。IgG阳性说明患者感染或曾经感染过弓形虫, 一般多为慢性感染。由于IgM不能通过母体胎盘传给胎儿, 所以一般认为脐带血清中分离的IgM是确诊先天性感染的依据, 而出生后5个月内的婴儿如果检出IgG则不能确诊为先天性感染。IgE与IgG同时出现, 峰值出现在感染后2~3个月, 然后迅速下降, 存在时间短, 有助于确定近期感染。此外, 由于弓形虫常经口感染, 感染后机体产生IgA分泌入唾液中, 而IgA能持续数月至1年, 在急性、慢性感染及血清检测阴性的感染者唾液中均可检出IgA。先天性感染新生儿IgA抗体比IgM更常见, 因此唾液中的IgA检测是判断新生儿感染的附加方法, 怀疑先天性感染的所有新生儿应同时检测IgA和IgE抗体。见表1。

表1

表1

表1 弓形虫感染的抗体检测 项目 血清中出现时间 持续时间 用途 检测方法 IgM 感染后5~7 d 下降比IgG快, 6~9 个月转为阴性 急性感染* ; 脐血中检 出提示先天性感染 IgM-ELISA, ISAGA IgG 感染后1~2周* * 1~2个月达到高 峰, 常持续终生 既往/慢性感染, 滴度 升高提示活动性感染 DT, IgG-ELISA, IFT, ISAGA, 免疫印迹试验 IgE 感染后1~2周 2~3个月达到高 峰, 然后迅速下降 近期感染 IgE-ELISA IgA 感染后1~2周 数月至1年 先天性弓形虫病、眼弓 形虫病的辅助诊断[9] IgA-ELISA, ISAGA IgG亲和力 感染后1~2周 5个月内表现为低亲和力 (< 15%~25%), 慢性感 染表现为高亲和力(> 30%) 确认慢性感染 或新近感染 IgG亲和力的ELISA 注:* 最近有报道弓形虫特异性IgM可持续5年, 这种结果应为慢性感染[7]; * * 有研究发现, 螺旋霉素的使用可以延迟特异性IgG的出现[10]; ISAGA为免疫吸附凝集试验; DT为染色试验

表1 弓形虫感染的抗体检测

近几年, 国外弓形虫IgG亲和力测定正在兴起, 患者出现症状后5个月内亲和力低(通常< 25%), 高亲和力(> 30%)被认为是慢性感染, 其是已发现的慢性感染的最有用指标之一, 可排除急性感染^[11]。其原理是抗原刺激初期形成的抗体亲合力低, 随着抗体的成熟, B细胞的选择过程使抗原-抗体结合位点互补性增强, 从而使抗体亲和力经数周至数月而逐渐增强。检测时, 取双份血清, 其中1份经尿素处理分离低亲和力抗体, 计算2个终点滴度比值, 以百分数表示。 IgG亲和力测定目前欧洲已有试剂盒供应, 有市售成品, 如bioMé rieux VIDAS、Bouty Beia IgG等。我国应用不多。

具体实验方法包括DT、IFT、补体结合试验(CF)、凝集试验(AT)、间接血凝试验(IHA)、ELISA、ISAGA、放射免疫试验(RIA)、金标法等, 每种方法各有利弊, 没有一种抗体检测能够单独确诊患者感染, 因此实验室可根据自身实际情况选择多种试验或进行联合检测。见表2。

表2

表2

表2 检测弓形虫感染的试验及结果判定[12] 试验分类 试验名称 活动性感染 既往感染 非活动性感染 基本试验 DT/IFT 血清转化, 间隔1~2 周滴度上升≥ 2倍, 滴度≥ 1:4 096 滴度下降≥ 2倍, 且滴度≤ 1:1 024 滴度1:4, 可高至1:256 必需补充试验 EIA* -IgG ISAGA或 EIA-IgM/IgA 血清转化 阳性 阳性 阳性 阳性或阴性 阳性或阴性 阳性 阴性 阴性 可选补充试验 IHA 大约感染2周后血清转化, 间隔1~2周滴度上升≥ 2倍 阳性 阳性 注: EIA为酶免疫标记法

表2 检测弓形虫感染的试验及结果判定[12]

目前, 实验室检测弓形虫应用最多的是ELISA, 市售试剂盒品种很多, 1 d内能发出实验报告, 敏感性和特异性令人满意。ELISA可用来检测弓形虫特异性IgM、IgG、IgE或IgA。由于酶的催化效率很高, 使测定方法具有很高的敏感性, 可用来定性、定量, 与DT符合率高, 但也有假阳性报道。近年在ELISA基础上发展起来的斑点ELISA(Dot-ELISA)、ABC-ELISA、单克隆抗体ELISA(McAb-ELISA)及免疫印迹试验等也已广泛应用于弓形虫检测。其中免疫印迹试验可望成为高度敏感和特异的诊断弓形虫病和区别感染的有效方法^[13]。据报道, 应用母-婴配对的IgG和IgM蛋白印迹试剂检测175例婴儿血清, 检测敏感性和特异性分别为67%和96%^[14]。

DNA探针、聚合酶链反应(PCR)等分子生物学技术现在也广泛应用于弓形虫的检测中。PCR检测可用标本包括脑脊液、羊水、胎盘、血液、尿液、玻璃体液、房水、支气管灌洗液及胸腹水, 最常用的是羊水PCR作产前诊断。基因检测敏感性、特异性都很好, 诊断价值高。但试验过程中, 尤其是PCR, 很多因素将影响试验结果, 易出现假阳性, 且检测成本较高, 使其应用受到了一定的限制, 通常用作血清学检测后的确认实验^[15]。

我国医院实验室进行弓形虫检测的标本来源主要有2个:一是获得性免疫缺陷综合征患者, 用于预防性检测和弓形虫感染治疗监测; 二是孕妇的产前检查, 多在刚地弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒(TORCH)检测中出现。其中, TORCH检测是我国医院中进行最多的弓形虫感染检测, 大多采用ELISA IgM/IgG法, 于孕妇孕早期取血1次进行检测。关于此项检查, 最近国外有文献报道, 若孕妇分别于10~20周、20~24周和6~9个月间进行至少3次弓形虫ELISA检测, ELISA的漏检率和先天性弓形虫病的发病率能够明显降低^[16]。而在众多检测手段中, 血清学抗体检测由于其操作简单, 仍是各实验室使用的首选方法。

国外已开始广泛应用全自动仪器如VIDIA、Abbott ARCHITECT、LIAISON等测定弓形虫IgM、IgG和IgG亲和力, 报告结果更快, 2~3 h完成试验, 敏感性、特异性比手工ELISA更高。IgG亲和力、循环抗原检测及基因芯片等是近几年出现的较新的弓形虫检测方法, 具有很好的检测性能。此外, 近年研究者发现的热休克蛋白70, 可作为弓形虫急性致死性感染的危险信号^[17]。相信随着试验技术的成熟, 在不久的将来这些新方法也能在实验室弓形虫检测方面有较好的表现和广泛的应用。