引用本文
卢培, 陆慧琦, 韩焕兴, 朱学源, 黄秋芳, 龚炜. 实时荧光定量PCR测定食管癌VEGF-C和VEGFR-3基因表达. 2009, 24(5): 355-360
LU Pei, LU Huiqi, HAN Huanxing, ZHU Xueyuan, HUANG Qiufang, GONG Wei. Detection of VEGF-C and VEGFR-3 gene expression in esophageal carcinoma by real-time fluorescent quantitative method. Labratory Medicine, 2009, 24(5): 355-360  
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实时荧光定量PCR测定食管癌VEGF-C和VEGFR-3基因表达
卢培1, 陆慧琦2, 韩焕兴2, 朱学源1, 黄秋芳1, 龚炜1
1.上海市第八人民医院检验科,上海 200235
2.第二军医大学附属长征医院实验诊断科,上海 200003

作者简介:卢 培,男,1967年生,学士,副主任技师,主要从事临床免疫学工作。

基金:上海市科技攻关医学临床研究(064119638)
摘要
目的

建立测定血管内皮生长因子-C(VEGF-C) mRNA和血管内皮生长因子受体-3 (VEGFR-3) mRNA的实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR),探讨其在食管癌组织及其癌旁组织中的表达水平。

方法

分别以自行构建和克隆的pMD18-VEGF-C和pMD18-VEGFR-3质粒作为定量模板,用循环阈值(Ct)定量起始的模板,在荧光TaqMan方法的基础上建立了测定VEGF-C mRNA和VEGFR-3 mRNA的实时FQ-RT-PCR,并分别测定了40例食管癌组织及其癌旁组织中VEGF-C mRNA和VEGFR-3 mRNA的表达水平。

结果

VEGF-C mRNA和VEGFR-3 mRNA测定的线性范围均为103~108拷贝/μg总RNA;VEGF-C mRNA和VEGFR-3 mRNA高、低值的批内、批间变异系数( CV)在7.07%~12.49%之间。VEGF-C mRNA主要表达在癌组织中,而VEGFR-3 mRNA在癌组织与癌旁组织中表达无差异;VEGF-C mRNA与VEGFR-3 mRNA在癌组织与癌旁组织中表达存在相关性;24例淋巴结转移食管癌患者癌组织及其癌旁组织VEGF-C mRNA和VEGFR-3 mRNA水平与16例无淋巴结转移食管癌患者癌组织及其癌旁组织存在显著差异,提示有淋巴结转移的食管癌组织及其癌旁组织VEGF-C和VEGFR-3基因表达水平上调。VEGF-C mRNA和VEGFR-3 mRNA的表达水平与食管癌临床病理分期有密切关系。

结论

我们建立的测定VEGF-C mRNA和VEGFR-3 mRNA的实时FQ-RT-PCR灵敏、稳定、重现性好,可供VEGF-C、VEGFR-3基因表达的临床检测和研究。VEGF-C mRNA和VEGFR-3 mRNA基因表达水平可作为食管癌淋巴结转移的预测指标,亦可作为分子水平上判定食管癌临床分期的辅助指标之一。

关键词: 血管内皮生长因子-C; 血管内皮生长因子受体-3; 食管癌; 淋巴结转移; 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应
中图分类号:Q503 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2009)05-0355-06
Detection of VEGF-C and VEGFR-3 gene expression in esophageal carcinoma by real-time fluorescent quantitative method
LU Pei1, LU Huiqi2, HAN Huanxing2, ZHU Xueyuan1, HUANG Qiufang1, GONG Wei1
1.Department of Clinical Laboratory,the Eighth People's Hospital,Shanghai 200235,China
2.Department of Laboratory Diagnostics,Changzheng Hospital,the Second Military Medical University, Shanghai 200003,China
Abstract
Objective

To establish a real-time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (FQ-RT-PCR) method for the detection of vascular endothelial growth factor-C(VEGF-C) mRNA and vascular endothelial growth factor receptor-3(VEGFR-3) mRNA, with which VEGF-C mRNA and VEGFR-3 mRNA level in esophageal carcinoma and pericarcinoma tissue can be analyzed.

Methods

The self-constructed and cloned plasmids pMD18-VEGF-C and pMD18-VEGFR-3 were used as quantitative templates respectively and the qua.pngication of initial cDNA was based on the cycle threshold(Ct) values, the real-time for quantitative detecting VEGF-C mRNA and VEGFR-3 mRNA was set up based on fluorescent TaqMan methodology to examine the specific expression level of VEGF-C mRNA and VEGFR-3 mRNA in esophageal carcinoma and pericarcinoma tissue.

Results

The detection linear range of the VEGF-C mRNA and VEGFR-3 mRNA assay was 103-108copies/μg total RNA respectively. The inter-assay and intra-assay coefficient of variation ( CV) of VEGF-C mRNA and VEGFR-3 mRNA for lower value and higher value was from 7.07% to 12.49% . The VEGF-C mRNA level in esophageal carcinoma tissue was markedly higher than that in pericarcinoma tissue, there was no significant difference of the VEGFR-3 mRNA level between carcinoma and pericarcinoma tissue.There was correlation between the level of VEGF-C mRNA and VEGFR-3 mRNA in carcinoma or pericarcinoma tissue. The levels of VEGF-C mRNA and VEGFR-3 mRNA in esophageal carcinoma and pericarcinoma tissue from 24 patients with lymphatic metastasis of esophageal carcinoma were significantly higher than that from 16 patients without lymphatic metastasis of esophageal carcinoma. The levels of VEGF-C mRNA and VEGFR-3 mRNA were associated with the clinicopathological stage of esophageal carcinoma.

Conclusions

A sensive, accurate,stable and reproducible FQ-RT-PCR for the quantitative detection of VEGF-C mRNA and VEGFR-3 mRNA has been established. The method could be applied in clinical detection and exploring the expression of VEGF-C and VEGFR-3 gene. The VEGF-C mRNA and VEGFR-3 mRNA levels could be an useful predicting marker for lymphatic metastasis and an assistant indicator for clinical stage of esophageal carcinoma.

Keyword: Vascular endothelial growth factor-C; Vascular endothelial growth factor receptor-3; Esophageal carcinoma; Lymphatic metastasis; Real-time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction

血管内皮生长因子家族是一组分泌型糖蛋白, 对造血、血管生成、淋巴管生成和血管通透性均有调节作用。血管内皮生长因子受体-3(vascular endothelial growth factor receptor-3, VEGFR-3)在胚胎早期的血管内皮细胞上广泛表达, 但在胚胎发育后期和出生后, 仅限制性地表达在淋巴管内皮细胞上[1, 2]。研究发现, 血管内皮生长因子-C(vascular endothelial growth factor-C, VEGF-C)有促进毛细管结构形成作用, VEGF-C与VEGFR-3结合, 两者形成的自分泌途径与肿瘤淋巴管生成关系密切, 肿瘤细胞产生的VEGF-C通过VEGF-C、VEGFR-3自分泌途径, 引起VEGFR-3激活, 促进淋巴管内皮细胞的增生及新生淋巴管形成, 最终导致淋巴结转移[2, 3]。本研究自行建立实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR), 并在此基础上定量测定了食管癌患者癌组织及其癌旁组织VEGF-C mRNA、VEGFR-3 mRNA表达水平。

材料和方法
一、标本来源

2007年8月至2008年3月在第二军医大学附属长征医院胸外科接受手术治疗的原发性食管癌患者40例, 男29例, 女11例, 年龄46~74岁, 符合1990年《中国常见恶性肿瘤诊治规范》原发性食管癌患者诊断标准, 临床病理资料完整。食管癌TNM分期:0期+Ⅰ 期5例, Ⅱ 期25例(Ⅱ A期11例, Ⅱ B期14例), Ⅲ 期10例; 其中有淋巴结转移24例, 无淋巴结转移16例; 术前未接受任何放射和化学治疗。手术后在食管癌组织原发灶取病理切片的同时, 取癌组织及其癌旁组织(避开坏死、炎症部位)置-70 ℃备用。

二、主要试剂和仪器

组织总RNA抽提试剂盒、胶回收试剂盒、质粒DNA抽提试剂盒(上海华舜公司), pMD18-T载体试剂盒、逆转录试剂盒、PCR试剂盒、实时PCR试剂盒、DNA marker (DL2000)(大连宝生物工程公司)。DU640紫外分光光度仪(美国Beckman公司), PTC-200扩增仪(Bio-rad公司), ABI Prism 7000荧光定量分析仪(美国ABI公司)。

三、引物、探针的设计和合成

依据GenBank收录的VEGF-C mRNA全序列NM_005429与VEGFR-3 mRNA全序列NM_002253, 利用Beacon Designer 2.1软件设计引物和探针, 均由上海生工公司合成, 序列见表1。

四、总RNA提取及cDNA合成

组织总RNA提取按说明书操作, 紫外分光光度仪检测总RNA的纯度(260与280 nm波长处吸光度比值为1.66~2.15)和浓度。按逆转录试剂盒操作说明书合成cDNA, 分装后置-70 ℃保存备用。

表1 靶基因引物、探针序列及扩增片段长度
五、目的DNA片段的扩增

PCR扩增体系50 μ L:Premix Taq 25 μ L, cDNA 2.5 μ L, 上、下游引物(20 μ mol/L)各1 μ L, 灭菌双蒸水20.5 μ L, 先设置梯度温度进行PCR反应, 以确定最适反应温度。VEGF-C mRNA和VEGFR-3 mRNA反应条件:预变性94 ℃ 2 min; 94 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min, 30个循环; 72 ℃延伸5 min。

六、VEGF-C和VEGFR-3质粒定值品的构建

VEGF-C和VEGFR-3的PCR产物经电泳、胶回收、纯化后, 与pMD18-T载体连接, 将连接产物转化JM109感受态细胞, 抽提、纯化重组质粒pMD18-VEGF-C 和pMD18-VEGFR-3, 鉴定阳性克隆, 测序证实该片段序列的准确性。

七、标准曲线的制备

将VEGF-C和VEGFR-3质粒定值品分别用灭菌双蒸水1:10稀释成108~102拷贝/μ L系列浓度的模板。反应体系50 μ L, 其中上述不同稀释度的2种标准模板1 μ L, Premix Ex Taq 25 μ L, 上、下游引物(20 μ mol/L)各 l μ L, ROX Reference Dye 1 μ L, 荧光探针溶液(10 μ mol/L) 1 μ L, 灭菌双蒸水20 μ L。反应条件:94 ℃10 s预变性; 94 ℃15 s, 60 ℃ 1 min, 40个循环。

八、实时FQ-RT-PCR检测食管癌组织和癌旁组织中VEGF-C和VEGFR-3基因表达

40例患者食管癌组织及其癌旁组织cDNA与不同稀释度的VEGF-C和VEGFR-3定值品按上述反应体系和反应条件进行扩增。根据扩增曲线和标准曲线, 计算出各标本VEGF-C、VEGFR-3基因表达的拷贝数, 除以该标本总RNA量, 即为单位质量的基因拷贝数(拷贝/μ g总RNA)。

九、统计学方法

用SPSS 11.5统计分析软件计算均值、变异系数(CV); 2组间比较分析采用Mann-Whitney U非参数检验方法, 2指标相关性分析采用Spearman相关分析方法, P< 0.05为差异有统计学意义。

结 果
一、VEGF-C和VEGFR-3 cDNA 扩增产物电泳

取5 μ L扩增产物行1%琼脂糖凝胶电泳。可分别观察到151 bp特异性扩增条带, 与预期的大小一致, 见图1。

图1 PCR扩增产物电泳图注:1为VEGF-C扩增片段; 2为VEGFR-3扩增片段; M为DNA marker

二、标准曲线的绘制

将不同稀释度的定值品同时进行定量PCR检测, 所得循环阈值(Ct)与其对应定量模板的对数作图, 绘制标准曲线, 见图2、3。VEGF-C mRNA和VEGFR-3 mRNA标准曲线的相关系数(r)均≥ 0.990。VEGF-C线性方程为Y=-2.680X+42.07; VEGFR-3线性方程为Y=-3.350X+47.44。

图2 VEGF-C标准曲线图

图3 VEGFR-3标准曲线图

三、不精密度分析

选择VEGF-C mRNA和VEGFR-3 mRNA高浓度标本和低浓度标本, 当日分别重复测定10次, 分别得到高、低浓度标本测定的批内CV; 同样将此2份标本连续测定6 d, 分别得到高、低浓度标本测定的批间CV, 见表2。

四、食管癌患者癌组织及其癌旁组织VEGF-C mRNA和VEGFR-3 mRNA测定结果

食管癌患者癌组织及其癌旁组织中VEGF-C mRNA和VEGFR-3 mRNA表达水平见表3。

表2 VEGF-C mRNA和VEGFR-3 mRNA测定的CV值(%)
表3 各组VEGF-C mRNA和VEGFR-3 mRNA定量测定结果(拷贝数/μ g总RNA)

1. VEGF-C mRNA和VEGFR-3 mRNA在食管癌患者癌组织和癌旁组织中的表达 食管癌患者癌组织VEGF-C mRNA表达水平显著高于癌旁组织(P< 0.001), 而癌组织与癌旁组织VEGFR-3 mRNA 的表达差异无统计学意义(P> 0.05)。在食管癌组织和癌旁组织中, VEGF-C mRNA与VEGFR-3 mRNA的表达水平均呈显著正相关(r值分别为0.838和0.815, P均< 0.001)。

2. VEGF-C mRNA和VEGFR-3 mRNA在食管癌淋巴结转移组与未转移组的癌组织及其癌旁组织中的表达 食管癌淋巴结转移组癌组织和癌旁组织VEGF-C mRNA和VEGFR-3 mRNA水平分别显著高于淋巴结未转移组(P均< 0.001); 2组的癌组织VEGF-C mRNA表达水平均显著高于癌旁组织(P< 0.001); 2组的癌组织与癌旁组织之间VEGFR-3 mRNA表达水平的差异均无统计学意义(P均> 0.05)。

3. VEGF-C mRNA和VEGFR-3 mRNA在食管癌患者癌组织的表达水平与临床病理分期的关系 VEGF-C mRNA的表达水平在Ⅱ A期与Ⅱ B期、Ⅱ A期与Ⅲ 期间差异有统计学意义(P均< 0.01), 在0期+Ⅰ 期+Ⅱ 期与Ⅲ 期间差异亦有统计学意义(P< 0.05)。 VEGFR-3 mRNA的表达水平在Ⅱ A期与Ⅱ B期、Ⅱ A期与Ⅲ 期间差异均有统计学意义(P均< 0.001﹚, 在Ⅱ A期+Ⅱ B期与Ⅲ 期、0期+Ⅰ 期+Ⅱ 期与Ⅲ 期间VEGFR-3 mRNA的表达水平差异均有统计学意义(P分别< 0.05和< 0.01)。VEGF-C mRNA和VEGFR-3 mRNA的表达水平与食管癌临床病理分期有密切关系, 尤其在食管癌早期与中晚期间差异显著。

讨 论

我国是世界上食管癌发病率和死亡率最高的国家之一, 食管癌的发病机制尚未完全阐明, 早期主要通过淋巴转移, 晚期可经血行转移。部分中晚期食管癌患者伴有淋巴转移, 疗效不佳, 预后较差, 生存率下降。因此研究癌细胞淋巴管转移机制, 寻找提示淋巴结转移的分子标志物有着重要意义。

VEGF家族是一组分泌型糖蛋白, 对造血、血管生成、淋巴管生成和血管通透性均有调节作用, 与许多生理病理过程相关。VEGF-C由Joukou等[2]于1996年从人类前列腺癌细胞中克隆纯化, 人VEGF-C基因位于染色体4q34, 编码相对分子质量为4 690、含419个氨基酸残基的蛋白, 有促进毛细管结构形成作用, 在人体心脏、胎盘、骨骼肌、卵巢、小肠等组织中均有弱表达。VEGFR-3是VEGF-C的受体之一, 由Aprelikova等[4]于1992年从人的胚胎和白血病细胞cDNA文库中克隆得到, 位于染色体5q33~q35, 编码相对分子质量为180 000的糖基化单链跨膜蛋白, 是胚胎期胚胎血管形成的必需因素, 在血管和淋巴管内皮细胞都有分布, 成年后仅限表达于淋巴内皮细胞。目前比较一致的观点是, VEGFR-3不仅是淋巴管内皮细胞的特异性标志物, 而且也是淋巴管生成的调节因子[5]。

肿瘤细胞能产生大量VEGF-C, 并可通过VEGF-C和VEGFR-3自分泌或旁分泌途径与受体VEGFR-3结合, 引起VEGFR-3的激活, 使受体自身磷酸化, 细胞有丝分裂增加, 诱导淋巴管内皮细胞增殖, 从而使淋巴管扩张或增生, 形成新生的淋巴管, 肿瘤外周淋巴管数量增加, 管腔扩张, 区域淋巴结转移率增高[6], 从而明确了VEGF-C和VEGFR-3在肿瘤的淋巴管生成和淋巴结转移过程中的重要作用, 淋巴转移在食管癌中的特殊地位决定了食管癌可以作为研究VEGF-C和VEGFR-3与肿瘤淋巴转移机制的良好载体[7]。

本研究发现VEGF-C主要表达在食管癌组织中, 癌组织VEGF-C mRNA表达水平均显著高于癌旁组织(P均< 0.001); 本研究同时发现不论在食管癌组织还是癌旁组织中VEGF-C与VEGFR-3呈明显的正相关(r值分别为0.838和0.815, P均< 0.001), 显示VEGF-C 与VEGFR-3呈同步增长可能是肿瘤细胞产生的大量VEGF-C与VEGFR-3结合后, 激活VEGFR-3, 致使VEGFR-3表达也随之增加之故, 这与Arinaga等[3]的报道一致。本研究结果表明, 转移组的食管癌组织和癌旁组织中VEGF-C和VEGFR-3与未转移组差异均有统计学意义(P均< 0.001), 提示VEGF-C与VEGFR-3与肿瘤淋巴结转移之间关系密切, 与Saintigny等[6]的结果一致; VEGF-C与VEGFR-3系统促进食管癌淋巴转移的作用可能与以下机制有关:(1)食管癌细胞产生VEGF-C与淋巴管内皮细胞上VEGFR-3受体结合, 刺激淋巴管内皮细胞增殖, 形成新生淋巴管及增加淋巴管通透性, 导致食管癌组织和癌旁组织中淋巴管密度增高, 为肿瘤细胞的淋巴管转移创造有利条件; (2)相对于血管系统而言, 淋巴管更有利于肿瘤细胞的扩散、存活及转移; (3)VEGF-C可能改变了表达于淋巴管内皮细胞的黏附分子和原有淋巴管功能, 使之对肿瘤细胞的趋化性、淋巴管侵入和播散变得活跃[8]; (4)VEGF-C不仅可促进癌组织和癌旁组织内形成新生淋巴管, 而且可促进原有淋巴管增生, 管径增加, 并诱导淋巴管间及淋巴管与血管相互融合, 从而促进淋巴转移[9]。

既往的研究认为肿瘤组织中不存在淋巴管, 这难以解释肿瘤的淋巴管转移。Mihaela等[10]和Veikkola等[11]应用基因转染方法, 使乳腺癌细胞表达VEGF-C, 然后将其接种于裸鼠, 证实VEGF-C可诱导肿瘤内淋巴管的新生。肿瘤组织染色切片中分布有许多小的淋巴管, 而对照鼠的肿瘤中淋巴管仅深入肿瘤约2 mm, 前者淋巴管密度约为后者的4.6倍, VEGFR-3的表达也相应的增加, 且这种增生的淋巴管中常包含肿瘤细胞。在肿瘤组织及肿瘤周围包膜区存在集束状或分散的淋巴管, 这种淋巴管的分布较正常皮肤的淋巴管致密。本研究显示, 2组VEGFR-3 mRNA在癌组织和癌旁组织表达水平相近, 提示肿瘤及其周围组织均有VEGFR-3参与淋巴管的生成。

我们在研究中注意到, VEGF-C mRNA和VEGFR-3 mRNA不仅在转移组癌组织中升高, 而且在部分未转移组癌组织中升高, 并高于转移组癌组织中最低水平, 这一发现提示在病理阴性的组织内可能已经发生了分子转移行为或者说有微淋巴管的生成和微淋巴结转移存在。有研究发现, VEGF-C有促进毛细管结构形成作用, VEGF-C除与VEGFR-3结合外, 还可与结合力较低的VEGFR-2结合, 参与微血管形成, 不排除VEGF-C 作为次要参与者同时参与肿瘤血管的形成[2]。从分子水平上检测肿瘤微小转移的发生, 对病理诊断是一项有益的补充, 有待追踪患者病情演变来进一步证实其作为肿瘤早期转移分子标志物的可靠性。这将为肿瘤淋巴转移的临床诊断提供新的思路[7]。

食管癌的临床病理分期不仅是判断预后的重要指标, 也是指导临床治疗的基本依据。本研究发现, VEGFR-3和VEGF-C的表达水平在肿瘤的早期与中晚期之间差异显著, 初步提示VEGF-C和VEGFR-3的表达水平与肿瘤的临床分期相关, 这与文献报道一致[12, 13]。进一步扩大样本, 揭示VEGF-C和VEGFR-3的表达水平与肿瘤临床分期的确切关系, 将为临床提供新的分子标志物, 可作为TNM分期的有益补充。

我们建立的测定VEGF-C mRNA和VEGFR-3 mRNA的实时FQ-RT-PCR, 具有灵敏、稳定、重现性好的特点, 可用于分析其他肿瘤中VEGF-C、VEGFR-3基因表达。明确各种肿瘤VEGF-C mRNA和VEGFR-3 mRNA的表达水平, 扩大研究样本以及追踪患者病情的演变和预后, 以进一步证实VEGF-C mRNA和VEGFR-3 mRNA作为分子标志物的可靠性, 将为肿瘤的抗淋巴管转移治疗提供理论和实践基础[14], 为寻找新的抗癌药物的治疗靶点提供依据, 这对恶性肿瘤的诊断、分期、预后判断和术后化疗方案的选择等将具有指导意义。

The authors have declared that no competing interests exist.

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