引用本文
赵琪, 黄学文, 潘杰, 安仙园. 靶向23SrRNA domain Ⅱ区的肽-多肽核酸抑制细菌生长的研究. 2009, 24(5): 339-342
ZHAO Qi, HUANG Xuewen, PAN Jie, AN Xianyuan. Inhibition of bacterial growth by peptide-peptide nucleic acid targeted to domainⅡof 23SrRNA. Labratory Medicine, 2009, 24(5): 339-342  
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靶向23SrRNA domain Ⅱ区的肽-多肽核酸抑制细菌生长的研究
赵琪1, 黄学文2, 潘杰2, 安仙园2
1. 无锡市人民医院检验科,江苏 无锡 214023
2. 华东疗养院检验科,江苏 无锡 214065

作者简介:赵 琪,女,1971年生,学士,主管技师,主要从事微生物学研究。

通讯作者:黄学文,联系电话:0510-85518442-8305。

摘要
目的

研究靶向23SrRNA domainⅡ区的肽-多肽核酸(PNA)(G1138)抑制细菌生长的效果。

方法

用浊度分析观察肽-PNA(G1138)抑制大肠埃希菌DH5α的生长,用克隆形成单位进一步分析肽-PNA(G1138)抑菌效果。

结果

肽-PNA(G1138)显示出剂量和序列特异性抑制细菌生长,但肽-PNA(G1138)的最低抑菌浓度(MIC)明显高于四环素,抑制效果低于四环素,他们的MIC分别为10和4 μmol/L。

结论

10 μmol/L 的肽-PNA(G1138) 能够抑制大肠埃希菌DH5α的生长,但与四环素和其他靶向23SrRNA domain V区的PNA比较起来抑菌效果不理想。筛选更有效的转运肽,提高肽-PNA(G1138)的抑菌效果,是以后研究中将要努力解决的问题。

关键词: 多肽核酸; 肽; 反义抑制; 23SrRNA
中图分类号:R446.5 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2009)05-0339-04
Inhibition of bacterial growth by peptide-peptide nucleic acid targeted to domainⅡof 23SrRNA
ZHAO Qi1, HUANG Xuewen2, PAN Jie2, AN Xianyuan2
1. Department of Clinical Laboratory, Wuxi People's Hospital, Jiangsu Wuxi 214023, China
2. Department of Clinical Laboratory, Huadong Sanatorium, Jiangsu Wuxi 214065, China
Abstract
Objective

To study the inhibition of bacterial growth by peptide-peptide nucleic acid(PNA)(G1138) targeted to domain Ⅱ of 23SrRNA.

Methods

The bactericidal effect of antibacterial peptide-PNA(G1138) conjugates on Escherichia coli( E.coli) DH5α was observed by turbidity analysis and further examined by colony-forming units.

Results

Peptide-PNA(G1138) targeted to domain Ⅱ of 23SrRNA could inhibit bacterial growth in a dose- and sequence-dependent manner, but the minimum inhibitory concentration(MIC) of peptide-PNA(G1138) against E.coli was significantly higher than that of tetracycline, the bactericidal effect was less effective than that of tetracycline. Their MICs were 10 and 4 μmol/L respectively.

Conclusions

Peptide-PNA(G1138) at 10 μmol/L can inhibit E.coli DH5α growth , but the inhibitory effect of peptide-PNA (G1138) is not satisfactory in comparison with tetracycline and other PNAs targeted to domain V of 23SrRNA. To screen more effective cell-permeabilizing peptide and to improve the bactericidal effect of peptide-PNA(G1138) are the aims of further research.

Keyword: Peptide nucleic acid; Peptide; Antisense; 23SrRNA

反义寡核苷酸抑制耐药细菌生长的研究已经表现出广阔的前景[1]。多肽核酸(peptide nucleic acid, PNA)是DNA类似物, 与寡核苷酸比较, PNA是更加有希望的反义抑菌药物[2~6], 然而PNA的有效吸收是其发挥反义作用的最大障碍[7, 8]。目前众多的研究表明, KFFKFFKFFK载体肽结合的PNA能有效被细菌吸收, 并且发挥反义抑制作用[9~11]。我们以前研究发现, 靶向23SrRNA domain Ⅱ 区的PNA(G1138)在体外具有良好的抑制细菌蛋白合成的效果[12], 因此我们合成KFFKFFKFFK-PNA(G1138), 进一步观察肽-PNA(G1138)抑制大肠埃希菌DH5α 生长的效果。同时, 以四环素、PNA(G1138)、肽-PNA(错配G1138)和肽-PNA(无关G1138)做对照。

材料和方法
一、主要试剂、菌株、PNA和肽-PNA

大肠埃希菌DH5α 为华东疗养院检验科保存。本研究所用PNA和肽-PNA由Biosynthesis公司合成, 见表1。蛋白胨、酵母粉、三氟乙酸(TFA)、NaCl均购自Sigma公司。PNA和肽-PNA用0.1% TFA溶解, 配成10 mmol/L储备液, -80 ℃保存, 使用时稀释。

表1 PNA和肽-PNA序列及其MIC
二、主要仪器

酶标仪(奥地利 128C), 凝胶成像系统(英国 SYNGENE), 消毒锅(Sanyo MLS-3750), 电子天平(上海衡平FC-104), 生物显微镜(奥林巴斯CX21), 改良牛鲍氏血细胞计数板。

三、浊度测定

取一细胞培养板, 在每孔加入10 μ L大肠埃希菌DH5α 培养物(已稀释至106 cfu/mL, 稀释液为10% LB液体培养基)和90 μ L含不同浓度PNA、肽-PNA或四环素的10% LB液体培养基(PNA和肽-PNA最终浓度分别为0、2、5、10、20和50 μ mol/L, 四环素最终浓度分别为0、1、2、3、4和5 μ mol/L)。混匀后, 于550 nm测定吸光度值。然后封闭培养板, 37 ℃, 200 r/min(离心半径为5 cm), 培养。于培养的3、6、9、12、15和18 h分别测定吸光度值。

四、克隆形成单位分析

吸取100 μ L已稀释至106 cfu/mL的大肠埃希菌DH5α 培养物, 加入到1 mL含有10 μ mol/L肽-PNA(G1138)和4 μ mol/L四环素的10% LB液体培养基中, 混匀, 37 ℃, 200 r/min(离心半径为5 cm), 培养。于培养的0、15、30、45、60、120、180和240 min分别取100 μ L涂布于LB固体平板上, 37℃培养过夜, 用英国SYNGENE凝胶成像系统中的菌落计数软件计算克隆形成单位数量。

结 果
一、肽-PNA抑制细菌生长效果观察

PNA(G1138)在10%LB培养液中无抑菌效果, MIC> 50 μ mol/L。肽-PNA(G1138)和四环素随着浓度增加, 抑菌效果越加明显, MIC分别为10和 4 μ mol/L。肽-PNA(错配G1138)和肽-PNA(无关G1138)在50 μ mol/L抑菌效果不明显。见图1~5。

图1 不同浓度PNA(G1138) 抑制大肠埃希菌 DH5α 生长

图2 不同浓度肽-PNA(G1138)抑制大肠埃希菌DH5α 生长

图3 不同浓度四环素抑制大肠埃希菌DH5α 生长

图4 不同浓度肽-PNA(错配G1138) 抑制大肠埃希菌DH5α 生长

图5 不同浓度肽-PNA(无关G1138) 抑制大肠埃希菌DH5α 生长

二、克隆形成单位分析

克隆形成单位的结果显示, 大肠埃希菌DH5α 在10 μ mol/L肽-PNA(G1138)中暴露4 h后, 克隆形成单位数量从68 000下降到0。而大肠埃希菌DH5α 在4 μ mol/L四环素中暴露1 h后, 克隆形成单位数量从69 800下降到0。见图6。

图6 肽-PNA(G1138) 和四环素抑菌效果比较

讨 论

PNA生物性质稳定, 不被核酸酶和蛋白酶消化降解。PNA肽骨架呈电荷中性, 与DNA/RNA的杂交物具有高度序列特异性和杂交稳定性[2]。PNA与互补链结合后在空间上能有效阻止逆转录酶、端粒末端转移酶和核糖体的正常功能[3~6], 因此PNA是更加有希望的反义抑菌药物。以往PNA抑制蛋白翻译和细菌生长的研究, 大多集中在16SrRNA的3'末端、5.8SrRNA和23SrRNA domain V区及mRNA的起始密码子部分[13~16]。而针对23SrRNA domain Ⅱ 区的反义PNA抑制细菌生长和蛋白合成的研究很少。我们以前研究证实了靶向23SrRNA domain Ⅱ 区的PNA(G1138)在体外翻译系统中能有效抑制蛋白的表达[12]。

PNA通过细菌细胞膜到达作用位点的速度十分缓慢, PNA不能被细菌有效吸收[17]。而且传统寡核苷酸的相对分子质量超过了大肠埃希菌细胞壁上非特异性孔道的极限[7], PNA(G1138)的相对分子质量更是高达3 099。2001年, Good等[9]研究表明阳离子载体肽KFFKFFKFFK能通过与带负电荷的细胞壁结合而提高细菌对PNA的吸收, 使PNA发挥反义抑制作用。随后, Eriksson[10]和Nekhotiaeva等[11]同样用KFFKFFKFFK成功转运了PNA, 使PNA发挥了理想的反义抑制作用。因此本研究选择KFFKFFKFFK作为载体肽, 合成KFFKFFKFFK-PNA (G1138), 观察其抑菌效果。

本研究结果显示, PNA(G1138)、肽-PNA(错配G1138)和肽-PNA(无关G1138)抑菌效果不明显, 而肽-PNA(G1138)随着浓度的增加, 抑菌效果更加明显。细胞摄入PNA确实很慢, 甚至不能穿透, 而KFFKFFKFFK能提高细胞摄入PNA(G1138)的能力, 并且肽- PNA(G1138)以剂量和序列依赖的方式抑制细菌生长。

虽然肽-PNA(G1138)能抑制细菌生长的结果非常令人振奋, 但抑菌浓度明显高于四环素。而且从克隆形成单位的结果可以看出, 大肠埃希菌DH5α 在10 μ mol/L肽-PNA(G1138)中暴露后, 克隆形成单位数量从68 000下降到0需要4 h, 而大肠埃希菌DH5α 在4 μ mol/L四环素中暴露后, 克隆形成单位下降到0仅需要1 h, 说明肽-PNA(G1138)发挥抑菌效果的速度明显慢于四环素。为什么在体外翻译系统中PNA(G1138)的抑制蛋白合成效果仅仅稍微低于四环素(抑制50%蛋白合成的浓度分别为0.15和0.12 μ mol/L)[12], 而肽-PNA(G1138)的抑菌浓度和速度与四环素比较起来却很高也很慢呢?可能有几种原因:(1)在体外翻译系统中, 阻止PNA(G1138)吸收的障碍不存在, 因此PNA(G1138)可以最大限度地发挥反义效果; (2)虽然PNA(G1138)与阳离子转运肽KFFKFFKFFK结合能提高PNA(G1138)转入大肠埃希菌的效果, 但可能并非十分理想; (3)因为肽-PNA(G1138)发挥抑菌效果的速度明显慢于四环素, 可能进一步提示肽-PNA(G1138)在穿过细菌外膜和内膜时存在转运问题, 因为肽-PNA(G1138)的相对分子质量是4 742, 超过了大肠埃希菌细胞壁上非特异性孔道所能通过的相对分子质量的极限。10 μ mol/L的抑菌浓度相当于47.42 μ g/mL, 相对于四环素的1.9 μ g/mL抑菌浓度实在太高。

不仅抑菌效果不如四环素, 肽-PNA(G1138)的MIC也明显高于已报道的靶向23SrRNA domain V区的PNA[9], 约是文献[9]中报道的5倍。除靶位不同外, 造成肽-PNA(G1138)如此高抑菌浓度的原因还可能与菌株的选择有关, 我们所用的实验菌株是大肠埃希菌DH5α , 而文献[9]所用的菌株是大肠埃希菌K12。

总之, 本研究表明肽-PNA(G1138) 能以剂量和序列特异性的方式抑制大肠埃希菌DH5α 的生长。虽然肽-PNA(G1138)与四环素和其他PNA比较起来抑菌效果不理想, 但肽-PNA(G1138)的抑菌能力却不容置疑。实验结果表明, 细菌摄入PNA的问题是PNA成为有效抑菌药物的最大障碍。筛选更有效的转运肽来克服PNA转运问题, 提高肽-PNA(G1138)的抑菌效果, 是以后研究努力的方向。

The authors have declared that no competing interests exist.

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