引用本文
张瑾. 海虾致敏个体过敏原的特异性探讨. 2009, 24(5): 333-335
ZHANG Jin. Research of allergenic differentia for lobster-sensitive subjects. Labratory Medicine, 2009, 24(5): 333-335  
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海虾致敏个体过敏原的特异性探讨
张瑾
台州市立医院检验科,浙江 台州 318000

作者简介:张 瑾,女,1969年生,副主任技师,主要从事临床生物化学和分子生物学检验工作。

摘要
目的

分析海虾的致敏蛋白,为海虾过敏原的纯化和标准化变应原疫苗的研制提供理论依据。

方法

取常规方法制备的海虾肌肉提取物,经十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后,用免疫印迹试验分析海虾过敏患者血清中抗体的特异性。

结果

SDS-PAGE结果显示,海虾肌肉粗提取物蛋白相对分子质量在10 000~70 000范围内。20例海虾过敏患者血清的免疫印迹试验表明,致不同患者过敏的海虾蛋白存在明显的差异性,但绝大多数患者均致敏的蛋白带的相对分子质量在30 000~40 000之间。

结论

海虾肌肉相对分子质量为30 000~40 000的蛋白可作为制备海虾标准化变应原疫苗和检测试剂的材料。

关键词: 海虾; 过敏原; IgE结合蛋白; 差异性
中图分类号:R446.62 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2009)05-0333-03
Research of allergenic differentia for lobster-sensitive subjects
ZHANG Jin
Department of Clinical Laboratory,Taizhou Municipal Hospital, Zhejiang Taizhou 318000,China
Abstract
Objective

To ide.pngy the major IgE-binding proteins in lobster in order to provide a theoretical basis for the purification of lobster allergens and the standardization of allergy vaccine.

Methods

The crude lobster muscle extract was prepared using routine methods. Following sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE )separation, the specific IgE-binding proteins were analyzed by immunoblotting with sera obtained from lobster allergic patients.

Results

Using SDS-PAGE,the crude lobster muscle extrat revealed a lot of discrete protein bands with the relative molecular mass ranging from 10 000 to 70 000.Western blot showed that the specific IgE-binding protein bands for different lobster allergic patients were significantly different,but the allergen bands with the relative molecular mass ranging from 30 000 to 40 000 were the common for most allergic subjects.

Conclusions

The lobster muscle proteins from relative molecular mass ranging from 30 000 to 40 000 could be used as materials for the preparation of standardized allergy vaccine and detection reagent.

Keyword: Lobster; Allergen; IgE-binding protein; Differentia

海虾(对虾、褐虾、大龙虾等)是我国的主要经济甲壳类动物, 也是通常报道发生过敏反应的食用海产品之一[1]。海虾过敏患者的临床表现有荨麻疹、血管性水肿、喉痉挛和哮喘等, 甚至可能威及生命。据文献报道, 相对分子质量从80 000到94 000的蛋白都可与过敏患者血清中的特异性IgE结合, 36 000的过敏原存在于甲壳类和软体类动物的肌肉中, 称为原肌球蛋白[2]。对海虾的过敏成分, 特别是不同海虾过敏患者的特异性IgE结合蛋白的差异性报道较少。本研究用免疫印迹试验分析了海虾过敏者血清中特异性IgE以及不同患者血清中特异性IgE结合蛋白带的差异性。

材料和方法
一、虾肌肉粗提取物的制备

新鲜活海虾购于台州市水产品市场。参照《变态反应学实验技术》[3]中的方法, 略加修改。取虾肌肉, 用吸水纸吸去水分后在液氮中将肌肉磨碎并移入三角瓶中, 加入丙酮-乙醚(2:1, V/V)混合液完全浸没肌肉。室温在摇床中振摇2 h, 静置后弃去带脂的有机溶剂。再加入有机溶剂反复脱脂至溶剂澄清。在通风柜中完全挥除虾肌肉中的有机溶剂后, 按肌肉:提取液为1:10(W/V)的比例在4 ℃下连续搅拌抽取48 h。提取液为pH值7.4的50 mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS), 内含二硫苏糖醇(DTT)0.2 mmol/L和蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟化物 (PMSF)1 mmol/L。浸提取液经4 ℃下14 000 r/min(离心半径为7.9 cm)离心10 min; 上清液在4 ℃下用10 mmol/L PBS(pH值7.0)透析48 h, 然后冷冻干燥获得虾肌肉粗提取物。

二、血清的来源和制备

以临床病史、皮肤斑贴试剂(北京源康医学实用责任有限公司)和检测海虾抗食物过敏原特异性IgE的酶联免疫吸附试验(杭州浙大生物基因工程有限公司)检测过敏原呈阳性反应为依据, 从2005年2月至2008年3月台州市立医院门诊虾过敏患者的血液分离、分装、贮于-70 ℃下的血清中, 随机抽取20例海虾过敏原试验阳性的患者血清。以检测呈阴性反应的无过敏健康人血清为对照。阳性反应血清的20例虾过敏患者中, 有哮喘史者占61%, 有过敏性皮炎症状者占46%, 有过敏性鼻炎症状者占52%。

三、十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析

参照Ayuso 等[4]的改良方法进行。将冻干的虾肌肉提取物用上样缓冲液[70 mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)-HCl, pH值6.8, 10%甘油, 2%SDS, 5%β -巯基乙醇, 0.05%的溴酚兰]配制成浓度为3 mg/mL的溶液, 煮沸5 min, 离心, 上清液上样入浓缩胶浓度为4%、分离胶浓度为15%的SDS-PAGE齿孔内。电泳电压为120 V, 待溴酚兰指示剂达底部约0.5 cm时电泳结束, 用考马氏亮兰染色, 再用脱色液充分脱色。

四、免疫印迹试验

按照文献[5]的方法改良。用Bio-Rad电转移系统将SDS-PAGE分离的蛋白带转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上, 转膜用丽春红染色确证蛋白已经转移到膜上。将转印的膜用脱脂奶粉封闭, 洗涤液清洗后, 分别用1:10稀释的虾过敏患者的阳性血清在4 ℃下保温16 h。洗涤, 加辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人IgE, 洗涤, 加四甲基联苯胺(TMB)显色/底物溶液, 显色后终止反应。

结 果
一、海虾肌肉粗提取物的蛋白成分

SDS-PAGE分析显示, 海虾肌肉粗提取物蛋白相对分子质量在10 000~70 000范围内有约20条蛋白带, 其中主带为13 000、17 000、22 000、26 000、27 000、31 000、34 000、36 000、41 000、45 000、49 000、53 000、58 000、66 000和69 000等。见图1。

图1 虾过敏患者血清IgE与海虾肌肉粗提取物的免疫反应性注: M为蛋白相对分子质量标准; 1为海虾肌肉粗提取物SDS-PAGE蛋白带的考马氏亮兰染色; 2~19为不同患者血清的免疫印迹; 20为正常健康人血清的免疫印迹

二、海虾肌肉粗提取物与海虾过敏患者血清中特异性IgE的反应性

免疫印迹试验结果表明, 海虾肌肉粗提取物与阳性患者中特异性IgE反应的阳性率为100%, 而与健康人血清的反应呈阴性, 见图1。在相对分子质量10 000~70 000范围内的蛋白带中, 20位患者血清检出相对分子质量在30 000~40 000范围的过敏原占94%, 其中与相对分子质量31 000、34 000和36 000的蛋白反应的血清分别占54%、73%、63%, 相对分子质量34 000和36 000很可能就是文献报道的原肌球蛋白; 与相对分子质量26 000、27 000和41 000蛋白反应的血清分别为34%、36%、39%, 而剩余的IgE结合蛋白带, 如相对分子质量13 000、 17 000和22 000等的蛋白反应的血清均< 22%。1例患者血清对海虾肌肉粗提取物的反应性较弱, 且未显示甲壳类动物共有的原肌球蛋白过敏原。

讨 论

本研究显示, 海虾的主要过敏原中有1条相对分子质量为34 000的蛋白, 与对虎纹虾、龙虾和蟹等的过敏原蛋白研究报道一致[6], 而Daul等[2]报道褐虾的主要过敏原为36 000的原肌球蛋白, 差异可能来自实验方法、所在的地域和种群的不同。且相对分子质量34 000和36 000蛋白均可能是原肌球蛋白, 只是糖化程度不同。深入验证需将他们分离纯化后进行氨基酸序列同源程度分析, 这将对虾类标准化变应原疫苗的研制提供启示。

免疫印迹试验结果表明, 海虾肌肉粗提取物与阳性患者中特异性IgE反应的阳性结果一致, 且检出相对分子质量集中在30 000~40 000范围的过敏原。其中相对分子质量31 000、34 000和36 000的过敏原阳性率较高(54%、73%、63%), 可为制备标准化变应原疫苗提供全面可靠的依据。

近年来的研究证实, 与经典的 IgE介导的速发型过敏反应不同, IgG介导的食物过敏反应即食物不耐受有其自身的特点[7], 他是一种由IgG与变应原形成免疫复合物引起的Ⅲ 型变态反应。从结果看出, 对等量海虾肌肉粗提取物, 不同患者个体呈现不同的血清反应性, 即血清中特异性IgE结合的过敏原不同, 反应强弱也各异。这一现象提示有些患者的海虾过敏是速发型占优势, 呈现较强的IgE结合带; 有些患者未见强IgE结合带, 可能是属IgG介导的免疫复合物型变态反应。因此, 对食物类标准化变应原疫苗的研制, 尚需同时研究IgE和IgG结合的过敏原成分, 这些工作的成果可望作为制备海虾标准化变应原疫苗和检测试剂的材料。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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