1.定义 miRNA由一大类约22nt的非编码小RNA组成, 其广泛地存在于从低等的病毒、线虫、植物到高等的动物机体中。作为内源性的翻译抑制因子, miRNA通过与靶mRNA的3'-非翻译区(untranslated region, UTR)的碱基互补配对而起作用。当其与mRNA不完全互补配对时, 会抑制翻译的过程; 而与mRNA完全互补配对时, 则切割或降解mRNA^[2]。

2.来源与作用机制 miRNA来源于一个初始转录产物primary-miRNA(pri-miRNA), 具有1个或多个茎环结构, 由RNA聚合酶Ⅱ 协助转录而来。Pri-miRNA在RNA酶Ⅲ -Drosha和Pasha/DGCR8的切割下产生1个60~110nt的miRNA的前体precursor-miRNA(pre-miRNA)。pre-miRNA通过输出因子exportin-5 转至胞浆, 在RNA酶Ⅲ -Dicer的切割下产生约22nt的成熟miRNA。miRNA通过翻译的抑制或mRNA的降解诱导目的基因的沉默, 这种机制在各物种间非常普遍, 并且具有时间、空间的特异性。由此可见, miRNA对机体的正常生长、发育具有调节作用。

3.miRNA和siRNA 近年来备受关注的RNA干扰(RNA interference, RNAi)是利用具有同源性的双链RNA诱导基因转录后沉默的一种方式。体内积累的双链RNA被Dicer酶切割成22nt左右的双链RNA片段, 即siRNA, siRNA片段与体内的酶结合形成RISC, 后者可特异性地与内源mRNA的同源区结合, 通过核酸内切酶argonaute的作用使mRNA降解, 从而导致基因沉默; siRNA也可以根据所需"沉默"的靶基因人工合成, 是基因治疗的工具之一。而miRNA是内源性22nt左右的单链RNA, 亦为Dicer酶加工的产物, 广泛存在于真核生物中, miRNA可抑制靶基因的翻译, 也可以导致靶基因的降解, 即在转录后水平和翻译水平上负调控靶基因的表达, 主要在发育过程中起作用。

miRNA通过诱导特定目标基因的沉默, 参与了机体一系列重要的生理过程, 如调控生物的生长发育、细胞分化、形态变化及细胞凋亡等。某些miRNA能够开启或者关闭决定正常细胞增殖或分化的基因开关, 当这些过程改变时会导致细胞增殖的失调, 从而导致肿瘤的形成。近年来, miRNA与肿瘤的关系已成为生命科学的研究热点, 其与多种恶性肿瘤, 如肺癌、乳腺癌等之间的关系被相继报道^[3~5]。

在肿瘤组织中常常存在一种或多种miRNA表达上调或者下调, 在同一种肿瘤的不同发展阶段, miRNA表达水平也不同, 这就为肿瘤基因诊断开拓了一条新思路。Lu等^[3]用液相芯片技术检测334个样本中217种哺乳动物的miRNA, 包括多种肿瘤的miRNA, 发现miRNA表达谱能够反映肿瘤的来源和分化阶段, 甚至能够区分分化较差的肿瘤, 比传统的mRNA表达谱更加精确。Yanaihara等^[4]用基因芯片技术分析了肺癌的miRNA表达谱, 发现在104种肺癌miRNA中有43种与相应的正常组织有明显差异, 其中8个miRNA和肺癌患的预后密切相关, 如高表达的has-mir-155和低表达的hsa-let-7-2提示预后较差。由此可见, 不同肿瘤具有不同的miRNA表达模式, 通过检测miRNA的表达谱, 有助于临床上对肿瘤进行诊断和分期。另外, 也有几个miRNA在所有的肿瘤中几乎都有表达水平的上调或下调, 且其作用靶点几乎位于已知的原癌基因上, 提示这几个miRNA在肿瘤的发生中担任重要角色。对其进行定量检测和研究将对临床诊断和治疗产生重要作用。Lowery等^[5]认为, 已有的实验证明miRNA可通过调节基因表达对许多细胞功能起到关键作用, 而且在癌症的发生过程中存在miRNA的失调或者突变。在乳腺癌中, miRNA以癌基因或者肿瘤抑制物的形式参与癌变过程, 作者评论了miRNA在乳腺癌的治疗、特别是在改善当前预测手段和实现个体化治疗癌症的目标中的潜在作用。

既然肿瘤组织中存在特异miRNA表达量的上调或下调, 就可以利用抑制致癌性miRNA和补充抑癌性miRNA的方法使两者的量达到平衡从而达到肿瘤基因治疗的目的。反义寡核苷酸是一种进行了某些化学修饰的并与特定靶标RNA序列互补的短链核酸, 可与目标RNA结合, 通过各种不同的机制影响靶标基因的表达。因此临床上可利用反义寡核苷酸转染癌细胞, 从而使过量表达的癌性miRNA得到抑制。对小鼠静脉注射拮抗miR-16、miR-122、miR-192和miR-194的与胆固醇偶连的反义寡核苷酸(antagomirs)后, 可在多个器官观察到相应miRNA的大量减少^[6]。而对于在肿瘤中表达下调的抑癌性的miRNA, 则可通过补充与其类似的小分子或转染pre-miRNA的方法以期达到抑制肿瘤或诱导凋亡的目的。miRNA用作肿瘤治疗靶点的研究才刚刚开始, 相信随着对miRNA研究的不断深入及检测技术的不断提高, 采用miRNA治疗肿瘤将会有更宽广的前景。

miRNA除了与肿瘤密切相关外, 还参与疾病的发生、发展, 如病毒感染、心血管疾病和自身免疫性疾病等。miRNA究竟在人类疾病中扮演什么角色, 如何更好地应用于疾病的诊断和治疗, 都是医学界正在探讨的问题, 而miRNA表达水平的检测是研究上述问题必不可少的手段。

要了解miRNA在机体中时间、空间的表达情况及其在机体生理、病理过程中所起的作用, 必须有合适的检测方法。以下介绍基于不同原理的检测miRNA表达水平的方法。

1.基于核苷酸杂交基础上的方法 基于核苷酸杂交基础上的方法有RNA印迹技术、原位杂交技术、基于微球的流式细胞术和微阵列技术等4种。(1)RNA印迹技术:RNA印迹技术是检测RNA的经典方法, 常用来评价其他miRNA检测方法的可靠性。但成熟miRNA分子片段太短且含量较低, 用传统的RNA印迹技术方法检测敏感性相对较低, 且要求的样本量相对较大。针对这种情况, Varallyay等^[7]用锁定核苷酸(locked nucleic acid, LNA)寡核苷酸探针代替传统的DNA寡核苷酸探针进行了改良。这种新型的探针热稳定性较高, 能够提高Tm值, 且会导致碱基堆积, 具有与DNA和RNA相似的水溶性, 并提高了检测miRNA的敏感性和特异性, 尤其适用于可获得的样本量少、miRNA表达量过低的情况, 或者可用来有效区分仅有几个核苷酸差异的miRNA。据报道改用LNA探针的RNA印迹技术检测成熟miRNA, 其效率比传统的使用DNA探针的RNA印迹技术提高了10倍以上。(2)原位杂交技术:原位杂交技术的优点是能够显示miRNA表达的位置, 甚至达到细胞定位的水平, 尤其适用于石蜡包埋或福尔马林固定后的样本。新发展的原位杂交技术其敏感性和特异性都要优于传统的方法。一种是基于LNA探针的方法, 这种技术用LNA探针代替了传统的DNA探针, 其优点如上文所述。另一种是基于RNA探针的原位杂交技术, 这种方法的洗脱条件更为严格, 使用氯化四甲铵和RNA酶A的联合洗脱液除去未杂交的探针, 为原位杂交提供了更高的序列特异性条件^[8]。但是, 原位杂交技术提供的miRNA定量信息量很少, 也不能提供miRNA序列的信息。(3)基于微球的流式细胞术:基于微球的流式细胞术(bead-based flow-cytometry)即液相芯片技术, 这种技术将流式细胞检测与芯片技术有机地结合在一起, 使生物芯片反应体系由液相-固相反应改变为接近生物系统内部环境的完全液相反应体系。此法利用聚苯乙烯微球作为反应载体, 不同的微球由不同的荧光编码所标记, 可被相应检测系统所识别。微球上可连接核苷酸探针或者蛋白质, 检测miRNA时连接的是长约10~12nt的miRNA捕获探针, 此探针与靶miRNA的3'端互补配对, 再加入8~10nt的报告探针与miRNA的5'端反应。反应结束后, 在检测系统中通过两束激光逐一通过检测流场的微球探针上的分类荧光和报告探针上的标记荧光进行检测, 从而实现对靶miRNA的定性和定量检测^[9]。由于整个反应过程都在混悬于液相中的微球表面上进行, 故也称为悬浮式点阵技术(suspension array technology, SAT)或多功能悬浮点阵(multi-analyze suspension array, MASA)或灵活的多种被分析物的检测(flexible multi-analyze profiling, xMAP)。这种技术与传统技术相比最大不同之处是:传统生物芯片依靠其承载基片上的坐标定位进行寻址, 而液相芯片则是根据微球颜色进行区分, 且整个过程都在液相中进行, 能够同时检测上百种目的基因, 故通量大、速度快, 灵敏度高、特异性好, 适用范围广且操作简单, 与固相芯片技术相比还具有成本低、可以进行定量分析等优点。但液相芯片必须防止可能的交叉污染; (4)微阵列技术:微阵列技术(microarray)也称生物芯片、DNA芯片或者基因芯片技术, 是一种平面的基质载体, 上面规则地、特异性地吸附着基因或基因的产物。当与荧光标记过的样本杂交后, 相应位置荧光信号的强弱即可反映对应基因表达的丰度。其优点是高通量, 可以一次分析人的整个基因组, 在10 min内定量获得3万多个基因的表达^[10]。用microarray检测miRNA的步骤与检测mRNA的步骤一样, 分别是总RNA的提取、miRNA的标记、微阵列的制备和杂交、数据的获取和分析。由于miRNA的相对分子质量太小, 在细胞中的含量少(约占总RNA的0.01%), 检出难度相对较大。于是有学者逐渐提出改进的方法, 如在总RNA提取阶段用100%的乙醇代替异丙醇可使miRNA沉淀更完全, 或用LNA作为捕获探针等。还有报道提出了免除miRNA标记的检测方法, 其采用了一种新的捕获探针, 当与互补的DNA或RNA杂交时荧光信号会增强, 从而被检测出来。用这种方法, 免去了目标分子的标记和杂交后的洗涤步骤, 提高了反应的速度和敏感性^{[11, 12]}。

2.夹板连接法 Maroney等^[13]提出了一种比较简单的夹板连接法, 不需要特别的仪器也无须经过PCR扩增。该方法需先设计一段与目标miRNA互补的脱氧核苷酸(桥连片段), 此片段除了与目的miRNA互补段(3' 端)外, 其5'端还有一段14nt的外延片段。同时设计一段与14nt外延片段互补的脱氧核苷酸(连接片段), 在其5'端用₃₂P进行标记。退火时miRNA与连接片段同时与桥连片段互补配对, 就产生了一个杂化双链, 其中一链中间有个缺口, 即miRNA与连接片段的交界处。用T₄DNA连接酶将此缺口连上, 就相当于用₃₂P对miRNA进行了标记。用磷酸酶除去游离的₃₂P标记的连接片段, 再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳, 对放射信号的强弱进行检测, 即可得到对应的miRNA量的信息。据称此方法比RNA印迹技术简便、快速, 也更敏感, 可用来进行大量样本的检测。

3.基于聚合酶链反应(PCR)基础上的miRNA检测方法 (1)RNA加尾和引物延伸逆转录(RT)-PCR法:miRNA的长度仅为22nt左右, 几乎只相当于一个引物的长度, 因此不能用传统的RT-PCR方法进行检测。可用RNA加尾和引物延伸RT-PCR法进行miRNA检测 ^[14]。首先提取总RNA, 继提取小RNA, 在小RNA3'末端由poly A聚合酶加上一段poly A尾巴, 然后用一个3'末端含有一段poly T 的长特殊引物将miRNA逆转录成cDNA, 所得到的cDNA的长度比较适合进行荧光定量PCR。Takuya等^[15]介绍的方法是在miRNA的5'端加上一段短序列, 或在其头尾各加上一段, 再进行逆转录。该方法的优点是简便、快速, 并且样本的用量也比RNA印迹技术少。Raymond等^[16]也介绍了一种基于引物延伸PCR的方法来检测miRNA和siRNA。这种方法先合成一个加尾的、针对所测miRNA的特异引物, 将miRNA逆转录成cDNA。接下来将带尾的cDNA进行PCR扩增。在第一个循环里用含有LNA的引物指导合成cDNA的互补链; 在随后的循环里, 用一个通用引物和上面提过的含LNA的引物和SYBR Green进行荧光定量PCR。(2)茎环引物(Stem-loop) RT-PCR法:Stem-loop RT-PCR法的特征是应用了一个单一的茎环状的引物, 避免对目的miRNA进行加尾。反应过程分两步。首先, 茎环状引物与目的miRNA分子的3'端结合, 引物3'端与miRNA3'端有6个互补配对的核苷酸, 然后用逆转录酶将之逆转录成cDNA第1链。其次是PCR反应。cDNA第1链的茎环状结构打开后链的长度增加了, 以其为模板即可进行传统的荧光定量PCR。茎环状引物的茎部为双链结构, 防止引物与pre-miRNA或其他长链RNA的杂交; 茎部的碱基堆积增强了miRNA和DNA异质双链的亲合力, 提高了逆转录的效率; 且茎环状结构展开后增加了miRNA的长度, 为随后进行的PCR反应提供了合适的模板。但由于该法用的是序列特异的探针和引物, 对于高通量的miRNA分析来说过于昂贵^{[17, 18]}。Tang等^[19]在逆转录时加入针对许多miRNA的多个特异引物, 初步PCR扩增用的是针对不同cDNA的特异上游引物和通用下游引物, 且小于20个循环。初步扩增结束后, 用产物做模板进行针对每一种miRNA荧光定量PCR。这种方法可以检测单细胞水平的miRNA, 因此特别适用于样本量很少的情况, 如早期胚胎干细胞等的检测。(3)小靶点定量聚合酶链反应(small-target quantitation PCR, SQ-PCR)法:该法包括3个反应步骤, 逆转录、DNA模板连接和连接产物的PCR扩增, 每个反应都被热失活所隔开。在逆转录反应时, miRNA被特异引物逆转录生成cDNA, 因各个miRNA之间至少可达到一个碱基的差别, 而差别处大多位于miRNA的3'端, 因此引物的末端应尽量位于miRNA的3'端高变区或附近, 引物长度应尽量缩短。在第2步反应中, cDNA与两个寡核苷酸互补配对, 互补配对后, 两个寡核苷酸之间的缺口可达到7个核苷酸的长度。每个寡核苷酸都部分与cDNA配对, 其余超出cDNA长度的部分露出在外, 称为M13+。缺口由T₄DNA连接酶所填补, 连接反应对缺口两端的碱基错配非常敏感, 尤其是3'端, 所以应尽可能将缺口的3'端设置于miRNA高变区之外。在第3步反应中, 以连接产物作为模板, 以M13+的正、反向引物作为PCR通用引物, 与特异的Taqman探针一起, 进行PCR扩增。由于逆转录和连接反应都以miRNA的中心和3'末端即区分miRNA成员的主要区域作为特异的靶标, 且T4DNA连接酶能够对碱基错配进行辨别, 因而这种方法具有较高的特异性, 交叉反应率低, 可作为定量检测短核苷酸的敏感的检测方法^[20]。

miRNA的检测方法在短短的几年里已经经历了从定性到定量的发展, 已问世的方法并不仅限于上述数种。就其原理分类, 基于核苷酸杂交基础上的方法是经典方法, 其中改良的RNA印迹技术的检测性能明显提高, 但操作较复杂, 适用于科研工作。基于PCR的方法, 特别是Stem-loop RT-PCR法具有较高的特异性和敏感性, 且操作简便, 更适合于临床应用。相信随着技术的不断进步, 将会有更多更先进的检测方法问世, 为miRNA的深入研究并应用于临床检测和治疗创造条件。