HPV属于乳多空病毒科(papovavidae)的乳头瘤病毒属, 其包括多种动物的乳头瘤病毒和HPV^[3]。人体皮肤及黏膜的复层鳞状上皮是HPV的惟一宿主, 电镜下病毒颗粒的大小、形状与口多瘤病毒极为相似。乳头瘤病毒具有种属特异性, 目前尚未能在组织培养或实验动物模型中繁殖。

1.生物学特性 HPV病毒颗粒直径为50~55 nm, 衣壳呈二十面体立体对称, 含72个壳微粒, 没有囊膜, 完整的病毒颗粒在氯化铯中浮密度为1.34 g/mL, 在密度梯度离心时易与无DNA的空壳(密度为1.29 g/mL)分开^[4]。HPV基因组是一闭环双股DNA, 相对分子质量5× 10⁶。按功能可分为早期区(E区)、晚期区(L区)和非编码区(NCR)3个区域。E区分为E1~E7开放阅读框架, 主要编码与病毒复制、转录、调控和细胞转化有关的蛋白。L区分L1和L2, 分别编码主要衣壳蛋白和次要衣壳蛋白。NCR是E区与L区间6.4~1.0 bp的DNA片段, 负责转录和复制的调控^[5]。

通过对HPV克隆基因的DNA杂交试验及酶谱分析, 以核苷酸同源性< 50%定为新型别, 至今已鉴定出60余型HPV, 每一型别都与体内特定感染部位和病变有关。HPV各型之间有共同抗原, 即属特异性抗原, 存在于L1蛋白, 其与牛乳头瘤病毒(BPV)有交叉反应。L2蛋白为型特异性抗原, 各型间不发生交叉反应。

HPV在体外细胞培养尚未完成, 其具有宿主和组织特异性, 只能感染人的皮肤和黏膜, 不能感染动物。HPV感染后在细胞内增殖, 细胞核着色深, 核周围有一不着色的空晕, 此种病变细胞称为空泡细胞(koilocytotic cell)。

病毒的结构蛋白组成:85%的HPV颗粒, 经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝聚电泳(SDS— PAGE)可以确定病毒有主要衣壳蛋白, 相对分子质量为56 000; 次要衣壳蛋白, 相对分子质量迁移于76 000处, 发现4种细胞组蛋白与病毒DNA相关。

HPV的类型很多, 近年来分子生物学技术证实, HPV有60种以上的抗原型, 即这一家族里有60多个相似而又不同的病毒(亚型), 其中至少有10个类型与尖锐湿疣有关(如6、11、16、18及33型, 最常见6和11型), 而第11、16和18型则是国外目前研究宫颈癌、外阴癌及阴颈癌的最热门的病毒型^[6], 其长期感染与女性宫颈癌的发生有关。如HPV16、18和33等型别与宫颈癌的发生关系密切, 用核酸杂交方法检出癌组织中HPV DNA阳性率达60%以上。所有HPV的基因组结构相似, 根据严格条件下进行的DNA杂交程序可确定病毒的型和亚型, 不同的HPV型DNA与其他类型DNA仅50%出现交叉杂交, 迄今已发现60余种HPV类型, 随着研究的深入, 将会鉴定出更多HPV新的类型。

2.致病性与免疫性 HPV主要通过直接或间接接触污染物品或性传播感染人类。病毒侵入人体后, 停留于感染部位的皮肤和黏膜中, 不产生病毒血症。临床常见的有:寻常疣(主要为1、2和4型), 又称刺瘊, 可发生于任何部位, 以手部最常见; 趾疣(主要为2和4型), 生长在胼胝下面, 行走易引起疼痛; 扁平疣(主要为3和10型), 好发于面部, 手、臂、膝为多发性; 尖锐湿疣(主要为6和11型), 好发于温暖潮湿部位, 以生殖器湿疣发病率最高, 传染性强, 在性传播疾病中有重要地位, 且有恶性变的报道。近年研究资料证明, HPV与宫颈癌、喉癌和舌癌等发生有关。

有关HPV免疫反应研究较少。在感染病灶出现1~2个月内, 血清内出现抗体, 阳性率为50%~90%, 病灶消退后抗体能维持数月至数年, 但无保护作用。用白细胞移动抑制和淋巴细胞转化等试验检测细胞免疫的结果不一致, 有人观察到病灶消退时细胞免疫增强。

3.致病原理 (1)E6和E7蛋白的转化作用:E6和E7蛋白可影响细胞周期的调控, 被认为在细胞转化及在肿瘤形成中起着关键作用^[7]。E6还能激活端粒酶, 使细胞不能正常凋亡。E6和E7蛋白不仅具有转化和致癌作用, 而且还具有对病毒基因和细胞基因转录的反式激活活性^[8]。此外, E6和E7蛋白可协同作用, 使中心体复制与细胞周期脱耦联, 干扰钫锤体检测功能, 进一步导致肿瘤细胞的发生和发展; (2)HPV与端粒酶:端粒酶是基本的核蛋白逆转录酶, 可将端粒DNA加至真核细胞染色体末端。端粒酶在正常人体组织中的活性被抑制, 在肿瘤中被重新激活, 端粒酶可能参与恶性转化。已报道宫颈癌组织中端粒酶阳性率可达92%, 且多呈强阳性。目前已证明HPV感染和端粒酶的活性^[9], 端粒酶的激活是高危型HPV感染宫颈上皮后, 由宫颈上皮内瘤变(CIN)向癌转化过程中的关键步骤; (3)HPV与免疫:HPV感染后, 影响机体防御病毒的免疫系统, 细胞免疫、体液免疫及局部免疫反应均发生相应改变。有效的细胞免疫可清除已存在的HPV感染, 而体液免疫则能阻止同一亚型的HPV再次感染^[10]。HPV能使细胞表面I类抗原(MHC)I类分子表达下降, 并抑制多肽MHCI类分子复合体转运至细胞表面, 从而阻止病原肽有效地在感染早期呈特异的T效应细胞, 降低细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对感染细胞的杀伤作用, 直到感染后期或恶变时, 抗病毒免疫反应才开始作用^[11]。HPV感染后是否导致瘤样病变主要取决于HPV亚型和个人的免疫状态。免疫力低下的人群, 如有症状的获得性免疫缺陷综合征患者、慢性移植排斥反应者及长期大量使用免疫抑制剂患者, HPV感染率比正常人高。

4.HPV感染演变 临床与实验研究显示, 人体感染HPV后有3种演变可能:(1)部分人的HPV感染, 经一定潜伏期后进一步发展成有临床表现的病变, 如尖锐湿疣、肿瘤等疾病; (2)部分人感染HPV后, HPV长期停留在皮肤黏膜中, 不引起明显的临床表现, 也不引起任何不适; (3)部分人HPV感染具有自限性, 经过一定时间后HPV感染可逐渐消失, 称为自行消退或自发性消退。

研究发现HPV感染后12个月内有70%的人不再感染, 如果有新型HPV感染则已感染的HPV亚型可能消失, 而且被新型HPV感染的妇女在6个月后不可能有相同HPV感染。还有研究发现, HPV感染持续时间越长其感染越难自行消失, 在HPV感染后第1个半年内可能有31%的人感染自行消失, 在第2个半年可能有39%的人感染自行消失, 第3个半年可能有11%的人感染自行消失, HPV持续感染的因素与年龄偏大、多种HPV亚型感染(多重感染)和/或高危型HPV感染有关, 感染不易消失的有HPV16、18、61和73型等。

1.捕获技术高危型HPV检测 该分析是由Digene公司推出的非放射性HPV DNA分析系统, 联合应用高效液相杂交法和敏感的化学发光信号扩增系统。现为第2代杂交捕获法(HC2), 能检测13种高危型HPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68型)和5种低危型HPV(6、11、42、43和44型)^[12]。敏感性和特异性均较高, HC2检测高危型HPV对高度宫颈鳞状上皮内瘤样病变(HSIL)的敏感性、特异性、准确性、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比和阴性似然比分别为100.0%、87.1%、87.3%、8.8%、100.0%、7.7和0.0。HC2的缺点为仅能定量不能分型。Agorastos等^[10]报道高危型HPV HC2检测联合细胞学检查, 对于CIN I度患者诊断的敏感性、特异性分别高达100.0%、97.2%, 因此意义重大。2种方法联合使用, 既减少了不必要的阴道镜检查及病理活检, 同时可延长随诊间隔时间, 可作为宫颈病变后随访指标。

2.PCR及核酸分子杂交技术 通过HPV通用引物PCR扩增待测基因片段使信号放大, 再应用型特异性探针(或引物)与扩增产物杂交判断型别(分型)。

3.基因芯片技术 指将大量探针分子固定于支持物上后与标记的标本分子进行杂交, 通过检测每探针分子的杂交信号强度获取标本分子的数量和序列信息, 可同时区分同一标本中的多种亚型的方法, 可判断多重感染。基因芯片对HSIL和宫颈癌的敏感性为96.0%, 明显高于细胞学的83.6%, 认为基因芯片技术HPV检测克服了细胞学筛查低敏感性的缺点。

4.组合靶基因自动检测 应用基因芯片和电传感技术对HPV进行快速分型检测, 基因芯片可对HPV多种亚型同时检测, 是多种亚型感染检测的好方法, 但应进一步完善以提高其敏感性和特异性。

5.微生物学诊断 疣的诊断主要依靠临床特点, 对不能确诊的病例, 可选择下列方法辅助诊断。(1)染色镜检:将疣状物作组织切片或生殖道局部黏液涂片, 用巴氏染剂染色后, 光镜下观察到特征性空泡细胞或角化不良和角化过度细胞, 可初步诊断HPV; (2)血清学试验:应用重组技术表达抗原检测患者血清中IgG抗体, 或抗原免疫动物制备免疫血清或单克隆抗体检测组织或局部黏液中HPV抗原; (3)尿液检测:Gupta等^[13]发现, 从感染HPV的女性及性伴侣感染HPV的男性中, 无创性地留取尿液即可进行HPV DNA检测, 女性病例中HPV阳性检出率为83%, 男性为67%, 差异有统计学意义, 因此认为此法可以用于共同监视男性和女性生殖道HPV感染, 且简便易行、无创伤。

目前没有一种特效药可以直接把HPV杀死, 我们可以采用的治疗方法大致有以下几种:

1.药物治疗 包括全身口服用药, 如利巴韦林; 局部药物治疗女性外阴、阴道及宫颈HPV, 包括胸苷酸合成酶抑制药、鬼囚毒素、三氯醋酸软膏以及抗病毒中药, 如以莪术油为主要成分的药物。

2.局部物理治疗 目前临床常用的局部物理治疗有微波、激光及冷冻等。

3.免疫治疗 免疫疗法指的是刺激人体自身免疫系统来抵抗癌症的治疗方法。免疫疗法在宫颈癌的治疗中属于辅助疗法。疫苗产生免疫反应, 可以杀死癌细胞或抑制癌细胞生长。临床常用的免疫药物为干扰素, 该药物能提高全身和局部免疫功能, 降低HPV感染及复发率。如目前已使用的重组人干扰素、干扰素胶囊等。白细胞介素-12(IL-12)也常用于临床HPV感染的治疗。Lui等^[14]研究认为, mIL-12可激活自然杀伤细胞及促进干扰素释放, 抑制HPV DNA阳性肿瘤细胞生长。可见免疫治疗的应用越来越广泛, 且疗效较好。

4.手术治疗 手术治疗适用于范围广、体积大、浸润深的病变, 但手术切除后应配合药物治疗, 以防术后复发。

预防HPV相关癌症的最有效的方法是研制特异性的疫苗, 诱导机体产生中和抗体, 激发保护性免疫反应, 达到有效预防与癌症相关型的HPV传播的目的, 降低宫颈癌的发生率, 且可降低与HPV感染弱相关的癌症, 如肛门、外阴或扁桃体癌的发生率。目前, 国际上已有20余种HPV相关疫苗进入动物和临床试验阶段, 根据其功能不同, 疫苗分为预防性疫苗和治疗性疫苗。预防性疫苗多以HPV的主要衣壳蛋白L1体外表达形成的病毒样颗粒(VLPs)为靶抗原, 诱导机体产生特异性中和抗体。治疗性疫苗则以HPV早期蛋白如改造过的E6、E7蛋白作为靶抗原, 诱导产生特异性的细胞免疫反应, 用于CIN和宫颈癌的免疫治疗。动物实验和临床实验结果显示, HPV疫苗在预防HPV感染及治疗由其感染所引起的相关疾病方面将有重要作用。

1.HPV预防性疫苗 可阻断HPV感染皮肤和黏膜, 一般由病毒衣壳蛋白L1或L1+L2组成, 在细胞内可自我组装成空心VLPs^[15], 其具有与完整病毒相同的抗原空间表位, 可激发机体的CD4⁺淋巴细胞介导体液免疫反应, 刺激机体产生保护性中和抗体。预防型疫苗种类较少, 主要以HPV的结构蛋白质形式存在。

2.HPV治疗性疫苗 可清除由HPV感染所引起的肿瘤残存病灶、宫颈不典型增生及生殖器尖锐湿疣, 阻断低危型病变向高危型及癌症的转变过程。主要分为蛋白质疫苗和基因疫苗。HPV引发上皮细胞的转化并最终导致癌变主要是由HPV转化基因E6、E7所致, E6可诱发P53的降解, E7可影响细胞周期的调控, 具有致癌作用。(1)HPV治疗性蛋白疫苗:该疫苗的抗原部分一般采用E6和/或E7, E7免疫原性优于E6, E6、E7融合后可提高免疫效果, 在使用或不使用佐剂的情况下均可产生细胞免疫反应。由于E6、E7蛋白本身的免疫原性较弱以及具有潜在的致癌性, 且野生型E6、E7不易被降解, 不利于抗原的递呈, 因此HPV E6、E7疫苗多经修改或融合其他蛋白以提高其免疫效果^[16]。蛋白质疫苗又分为多肽疫苗、融合蛋白疫苗、嵌合疫苗等; (2)HPV治疗性基因疫苗:基因疫苗可分为DNA疫苗和RNA疫苗。采用基因载体携带E6或E7基因进入抗原呈递细胞, 并持续表达抗原蛋白分子, 免疫系统识别抗原后被激活, 清除感染HPV的细胞。基因疫苗可持续表达抗原, 并易于构建和改造, 易于制成多价疫苗, 不需要佐剂, 热稳定性好, 成本低廉, 但同时存在免疫效果弱和重组复活等安全性问题。

3.DNA疫苗 DNA疫苗是将编码外源蛋白基因的质粒DNA直接导入体内, 外源基因表达后呈递给免疫系统, 分别诱导产生细胞免疫和体液免疫应答。当生殖道黏膜基底层鳞状上皮细胞暴露于病毒时, 就会感染HPV。有效预防HPV感染的疫苗应该在病毒入侵的局部提供免疫保护作用。分泌型免疫球蛋白 (SIgA)能够与病毒结合, 阻止其附着上皮细胞, 因此具有病毒中和活性的SIgA在预防局部感染和疾病的发生中起着重要的作用, 是预防病毒侵入的第一道防线 。

4.DNA重组活疫苗 DNA重组活疫苗使用细菌载体或病毒载体将目的基因导入机体, 能使感染细胞内源性表达目的的基因进行正确的翻译后修饰, 刺激产生CTL反应。目前研究的表达载体有痘病毒、腺病毒、分枝杆菌(BCG)、沙门氏菌等。痘病毒载体容量大, 感染效率高。研究证实, 表达E6、E7的重组痘病毒可使宿主产生CTL反应, 有较好的抗肿瘤效果^[17]。

5.其他疫苗 其他进行研究的HPV疫苗还包括多肽疫苗、树突状细胞疫苗等。在晚期宫颈癌患者中使用HPV16E7进行Ⅰ ~Ⅱ 期临床试验, 结果表明使用多肽疫苗是可行的, 为该类疫苗在健康人群中的应用奠定了基础^[18]。

综上所述, HPV是肿瘤的致病因子之一, 其致病机制非常复杂, 虽然对其生物学特性、致病原理、感染演变、检测方法、治疗及预防有了一定的了解, 但目前的研究表明, 子宫内膜癌标本均能检测出HPV, 且多数为单一型别感染, 其中HPV18占到69.53%^[19]; 正常增殖期内膜HPV检出率为66.7%, 正常分泌期内膜HPV检出率为16.67%, 均为单一型别感染, 且多以低危型别为主。这表明HPV的很多研究领域我们尚未涉及, 因此我们必须加强女性宫颈癌的筛查工作和相关知识的宣传工作, 提高宫颈癌的早期发现率, 同时加强HPV高危人群的监测、随访、定期复查和治疗工作, 这对预防宫颈癌、提高患者生活质量具有重大意义。