一株临床不常见念珠菌的检验
引用本文
刘学杰, 宣瑛, 娄峥. 一株临床不常见念珠菌的检验. 2009, 24(4): 289-291
LIU Xuejie, XUAN Ying, LOU Zheng. Detection of an uncommon clinical strain of Candida . Labratory Medicine, 2009, 24(4): 289-291
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LIU Xuejie, XUAN Ying, LOU Zheng. Detection of an uncommon clinical strain of Candida . Labratory Medicine, 2009, 24(4): 289-291
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一株临床不常见念珠菌的检验
作者简介:刘学杰,男,1983年生,主要从事微生物检验工作。
摘要
目的
对1株临床不常见念珠菌的检测进行探讨。
方法采用4种不同方法(ATB、DADE、Remel和分子生物学方法)对1株不常见念珠菌进行检测。
结果ATB、Remel系统检测结果为邹褶念珠菌;DADE系统检测结果为克柔念珠菌;分子生物学检测结果为近邹褶念珠菌。讨论 对于临床不常见的念珠菌,仅用生化反应鉴定是不够的,为了正确鉴定到种,必要时还要用分子生物学方法作核酸序列分析。
关键词:
念珠菌; 邹褶念珠菌; 近邹褶念珠菌; 检测
中图分类号:R379.4
文献标志码:A
文章编号:1673-8640(2009)04-0289-03
Detection of an uncommon clinical strain of Candida
Abstract
Objective
To explore the detection method of an uncommon clinical strain of Candida.
MethodsAn uncommon clinical strain of Candida was detected by four different methods (ATB, DADE, Remel, molecular biology method).
ResultsThe results of ATB and Remel system were Candida rugosa. The result of DADE system was Candida krusei. The result of molecular biology test was Candida pararugosa.
ConclusionsBiochemical reaction is not suitable for ide.pngication of the uncommon Candida. The nucleic acid sequence analysis could correctly ide.pngy the species of Candida.
Keyword:
Candida; Candida rugosa; Candida pararugosa; Detection
近年来, 由于免疫受损人群的出现, 各种侵入性诊断和治疗技术的运用, 广谱抗菌药物、激素、免疫抑制剂的广泛使用, 使得真菌感染有明显上升的趋势, 其中最常见的是念珠菌引起的感染。念珠菌属内有200多个种, 能引起人类感染的约10余种[1]。我们从一例患者的痰中分离出1株念珠菌, 经检验为临床不常见念珠菌。
材料和方法
一、材料和试剂
1. 菌株来源 从就诊于华山医院的一例患者的痰中分离出1株念珠菌, 由华山医院真菌室馈赠。
2. 培养基 科玛嘉显色平板(DIFCO干粉), 沙保弱培养基干粉(上海市医学化验所试剂厂)。
3. 鉴定系统 美国DADE公司Microscan Auto SCAN-4鉴定仪及配套4 h快速酵母菌鉴定板; 法国生物梅里埃公司ATB Expression鉴定仪及配套酵母菌鉴定板(RapID 32C板条); 美国Remel公司RapID Yeast Plus板条。
4. 分子生物学技术鉴定 法国生物梅里埃miniMAG核酸提取仪及配套试剂。DNA扩增引物由上海生工生物技术有限公司合成, 正向引物:5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3'; 反向引物:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。聚合酶链反应(PCR)反应体系(50 μ L)为:10× PCR缓冲液, dNTP引物, 模板DNA, Taq酶(10 000 U/mL), 牛血清白蛋白(BSA), 双蒸水。DNA序列分析程序:Blast软件。TC-96/T/H(a) PCR仪(杭州博日科技有限公司)。
二、方法
1. 培养基制备 按照产品标签要求配制显色培养基和沙保弱培养基。
2. 菌株转种和传代 将念珠菌接种显色培养基, 置35 ℃孵育48 h, 观察菌落性状。
3. ATB系统鉴定 挑取生长24 h的念珠菌菌落制备2麦氏浊度菌液, 接种RapID 32C板条, 30 ℃孵育, 分别在24和48 h用ATB Expression 鉴定仪判读鉴定结果。
4.DADE系统和Remel系统鉴定 从30 ℃培养48 h的沙保弱平板上取菌制备4麦氏浊度菌液, 接种4 h快速酵母菌鉴定板, 35 ℃孵育4 h后, 由Microscan Auto SCAN-4鉴定仪判读; 并接种RapID Yeast Plus板条, 置30 ℃孵育4 h, 对照比色板用肉眼判读结果。
5.DNA的提取 将新鲜的念珠菌制备成3麦氏浊度菌悬液, 用法国生物梅里埃miniMAG核酸提取仪及配套试剂提取DNA, 作为PCR模板。参照文献设计真菌保守区5.5 S、28S核糖体基因和ITS2基因区内引物, 引物1序列为:5'-GCATCGAT GAAGAACGCAGC-3'; 引物2序列为:5'-TCCTC CGCTTATTGATATGC-3'。50 μ L PCR反应体系中含10× PCR缓冲液5 μ L、dNTPs各200 μ mol/L、引物各0.1 μ mol/L, 模板DNA 5 μ L, Tap DNA聚合酶5 μ L。循环条件:95 ℃预变性5 min, 94 ℃变性30 s, 60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸60 s, 扩增30个循环, 最后一循环于72 ℃延伸7 min。取5 μ L扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳, 溴化乙锭染色, 紫外灯下观察, 以出现相对分子质量为500 bp的条带为阳性结果。PCR产物的纯化和测序由上海生工生物工程技术有限公司完成。
6.rDNA序列分析 将念珠菌rDNA保守序列特异区ITS(约500 bp)测序结果通过Blast程序分析并与GenBank中真菌核酸数据库比对, 得到最高相似度的念珠菌种(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)。
结 果
二、株鉴定
接种RapID 32C板条30 ℃孵育24或48 h, 分别用ATB Expression 鉴定仪判读, 鉴定结果为邹褶念珠菌; 用Microscan Auto SCAN-4鉴定仪判读4 h快速酵母菌鉴定板, 结果为克柔念珠菌; 用Remel公司的RapID Yeast Plus板条再作鉴定, 结果与ATB Expression 鉴定仪结果一致, 为邹褶念珠菌; 用Blast程序分析该株DNA约500 bp的保守序列ITS2, 测序结果与GenBank中真菌核酸数据比对, 与近邹褶念株菌符合程度为99%。
讨 论
从患者痰中分离出的这株念珠菌经ATB和Remel系统鉴定为邹褶念珠菌, DADE系统鉴定为克柔念珠菌。
就菌落性状而言, 邹褶念珠菌在显色平板上的菌落应较大, 呈蓝色, 表面不光滑; 克柔念珠菌应呈粉红色, 菌落较大, 表面粗糙。但该菌株在显色平板上呈紫红色小菌落, 表面光滑, 与邹褶或克柔念珠菌明显不同。就显微镜下单细胞形态而言, 邹褶念珠菌应为长梭形, 而该株为椭圆形。就生化特性而言, 邹褶念珠菌利用半乳糖, 有些菌不利用木糖; 克柔念珠菌对2种糖都不利用; 近邹褶念珠菌的生化反应模式更接近邹褶念珠菌。DADE系统将该株鉴定为克柔念珠菌可能是因为在规定时间内木糖的生化反应尚不完全, 若适当延长时间也会得到相同的鉴定结果。
对rDNA ITS2保守区作序列分析, 并与GenBank中真菌核酸数据库比对得到与近邹褶念珠菌的相似度为99%, 表明该株的分子生物学技术鉴定结果为近皱褶念珠菌。美国华盛顿大学Chen的工作也发现类似的情况[2]。该学者分离的一株临床株(uwfp-348)经法国生物梅里埃(API或VITEK)系统鉴定为邹褶念珠菌, 分子生物学鉴定为近邹褶念株菌。他将这一临床株与近邹褶标准株(ATCC 38774)作ITS1、ITS2与28S序列分析, 相似程度分别达到99.4%、99.4%和100.0%, 并发现邹褶和近邹褶2种念株菌在酵母菌的系统发育方面存在很大差异。
查找ATB、DADE、Remel 3个系统的菌种鉴定库, 发现库中尚未包括近邹褶念珠菌这一菌种, 对近邹褶及其类似临床不常见的念珠菌不能作出正确的鉴定结果。
本研究表明, 近邹褶念珠菌是临床不常见的念珠菌。细胞水平的鉴定方法适用于临床常见菌株, 对于少见的念珠菌仅用生化反应鉴定是不够的。为了正确鉴定到种, 必要时还要用分子生物学方法作核酸序列分析。
The authors have declared that no competing interests exist.
参考文献
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