引用本文
邵维杰, 曹丹如, 陈悦, 马建伟, 陈慧英, 陶义训. 一种检测粪便隐血的改良化学法. 2009, 24(4): 286-288
SHAO Weijie, CAO Danru, CHEN Yue, MA Jianwei, CHEN Huiying, TAO Yixun. An improved chemical method for fecal occult blood testing. Labratory Medicine, 2009, 24(4): 286-288  
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一种检测粪便隐血的改良化学法
邵维杰1, 曹丹如1, 陈悦1, 马建伟2, 陈慧英1, 陶义训1
1.上海市临床检验中心,上海 200126
2.上海市东方医院检验科,上海 200120

作者简介:邵维杰,男,1955年生,主管技师,主要从事免疫学检验工作。

摘要
目的

建立一种检测粪便隐血的改良化学法。

方法

用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)为主要原料制备成干片试纸,将试纸浸入粪便样本液,试纸呈蓝色即为阳性。

结果

能够检测到样本中血红蛋白(Hb)含量范围为 5~10 000 μg/mL,消化道中蛋白酶对Hb的消化对本法无影响。高浓度Hb样本能够引起免疫法钩状效应,在本法中无影响。

结论

改良的TMB方法要比目前常规使用的化学法更有优势,快速、简便、能够单人份检测,尤其是检测的灵敏度高和检测范围宽。在免疫法粪便隐血试验中同时应用化学法可以检出假阴性反应。

关键词: 隐血试验; 消化道; 出血; 3,3',5,5'-四甲基联苯胺
中图分类号:R446.13 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2009)04-0286-03
An improved chemical method for fecal occult blood testing
SHAO Weijie1, CAO Danru1, CHEN Yue1, MA Jianwei2, CHEN Huiying1, TAO Yixun1
1.Shanghai Centre for Clinical Laboratory,Shanghai 200126,China
2. Department of Clinical Laboratory,Shanghai East Hospital,Shanghai 200120,China
Abstract
Objective

To establish an improved chemical method for the determination of fecal occult blood test(FOBT).

Methods

A dry FOBT reagent was prepared using 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine(TMB) as main matieral.

Results

The range of detection of hemoglobin(Hb) was 5-10 000 μg/mL. Digestion of Hb by enzymes in gastrointestinal(GI) tract did not effect the FOBT detection with improved method.High concentration of Hb,which showed negative result immunological FOBT by hook effect,and had no influence in chemical FOBT.

Conclusions

Chemical methods are need to be used in FOBT. The improved TMB method is better than traditional chamical methods.It is rapid,simple and increases the sensitivity and the detection range. In FOBT chemical method should be used in addition of immunological method for avoiding false negative result.

Keyword: Occult blood test; Digestive tract; Bleeding; 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine

粪便隐血试验(FOBT)主要有化学法和免疫法2种。免疫法特异性强, 但粪便中血红蛋白(Hb)含量较高时会因高抗原量钩状效应或上消化道少量出血时经胃蛋白酶消化后抗原性发生改变也会出现假阴性结果。化学法简便、快速, 有时会出现假阳性结果, 但其对Hb及衍生物有较强的反应, 故2种方法联用可以提高检测结果的可靠性。由于传统的化学法还存在试剂需要临时配制, 保存期差, 敏感度较低, 我们参考了文献[1, 2], 研制了用于FOBT的改良化学法干片试纸(TMB试纸), 并进行了初步临床试验。

材料和方法
一、材料

1.主要试剂 3, 3', 5, 5'-四甲基联苯胺(TMB)(Merck公司), 过氧化脲(CalBiochem公司), 厚型层析滤纸(Whatman公司), 贝索公司隐血试剂(免疫法和匹拉米酮化学法联用), 邻联甲苯胺(上海金山亭新化工试剂厂)。

2.样本 粪便样本取自医院和正常人体检。

3.TMB试纸的制备 TMB和过氧化脲溶解于柠檬酸缓冲液后吸附于层析滤纸上, 干燥, 切割成8× 8 mm小块, 粘贴于一片8× 50 mm涤纶薄片的一侧前端, 装入一小铝箔袋内并放入干燥剂后封口。

4. Hb质控品(自行制备) 在人Hb中加入0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值7.4)中, 并加适量的蛋白保护剂和防腐剂。制备成低值Hb(20 μ g/mL)和高值Hb(2 000 μ g/mL)2种浓度的质控品。用于监测TMB试纸的质量。

5.样本稀释液 0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值7.4)。

6.Hb储存溶液 将新鲜抗凝血制备成含Hb 100 mg/mL的储存溶液, 备用。

二、检测方法

1. 基本原理 Hb具有类过氧化物酶的作用, 在过氧化脲的存在下, 可使TMB由无色变为蓝色, 并与Hb含量成正比, 敏感度高, 目测对比明显。

2. TMB纸片法 (1) 粪便样本的处理:在圆形塑料小杯(直径10 mm, 高20 mm)中加1 mL样品稀释液, 以一采样小棒采取约10 mg粪便样本放入后搅匀; (2) 将TMB试纸一端放入样本中浸湿, 2 s后取出。同时以样本稀释液作为空白对照, 和低值、高值质控品作相同操作, 2 min内目测, 无颜色为阴性, 显蓝色者为阳性, 按颜色的深浅大致判断其Hb的含量(因所显示的颜色在滤纸上可以稳定30 min, 故在此时间内观察结果都有效)。

3.免疫法和匹拉米酮化学法用采贝索公司FOBT试剂, 按说明书操作。邻甲苯胺法按《全国临床检验操作规程》(第3版)[3]操作。

三、结果判定标准

2 min内不显色、显浅绿蓝色、浅蓝色和蓝色分别为-、± 、+和++。10 s内显深蓝色为+++。即刻显蓝黑色为++++。

四、化学法与免疫法的对比实验

1.胃蛋白酶对Hb的消化试验 以Hb储存液配制Hb系列溶液(Hb为40 000、4 000、400、200、80、40、20、8、0 μ g/mL), 各吸出1份加入等量1%胃蛋白酶溶液, 混匀, 置37℃, 1 h(模仿在上消化道的作用时间)后分别加等量磷酸盐缓冲液(PBS)终止反应。另外把各Hb系列溶液用PBS作1:4稀释, 然后与经胃蛋白酶处理的样本一起用TMB试纸和免疫法检测。

2.胰蛋白酶对Hb的消化试验 方法同胃蛋白酶对Hb的消化试验, 不同处为胰蛋白酶溶液2%, 消化时间为4 h(模仿在下消化道的作用时间)。

3.免疫法的钩状效应试验 取消化道出血患者的柏油样粪便1.2 g, 加样本稀释液 1.2 mL搅匀, 在10支小试管内以样本稀释液作10个不同浓度稀释, 具体见结果中表3。然后以免疫法和TMB试纸分别检测各稀释度样品。

4. 初步临床试验 用TMB试纸与贝索公司的免疫试剂对30名健康人和81例各类疾病患者作FOBT比对试验。

结 果
一、3种化学法的比较检测

用TMB试纸与常规应用的邻联甲苯胺法[3]及匹拉米酮试剂对不同浓度的Hb溶液作敏感度比对试验, 结果见表1。 与2种常用的化学法相比, 本法的敏感度更高, 检测范围更宽, Hb最小检测限为5 μ g/mL, 最大检出量为10 000 μ g/mL。

表1 3种化学法对于不同浓度Hb溶液的比对测定结果
二、TMB试纸的稳定性实验

将TMB试纸存放于4 ℃及室温保存, 并分别于第1、5、15、30、60、90、120、180天对Hb含量为10 μ g/mL的样本检测。每次每个含量的样本重复做3次, 结果显示TMB试纸在4 ℃可以稳定6个月。

三、TMB试纸的重复性测定

选择Hb浓度为5 μ g/mL和10 000 μ g/mL的2个样品, 以某个批号的试剂对其分别进行20次测定, 并用6个批号的试剂分别进行3次重复检测。Hb为5 μ g/mL时2种测定结果均显示弱阳性反应, Hb为10 000 μ g/mL均显示强阳性反应。

四、胃蛋白酶和胰蛋白酶对Hb的消化试验

对各种条件消化的Hb溶液与未经消化的Hb溶液TMB试纸法检测的结果相同, 表明酶消化对化学法不产生影响。而胃蛋白酶及胰蛋白酶对Hb的消化均能减低免疫法的敏感度。见表2。

表2 胃蛋白酶和胰蛋白酶对Hb消化前TMB试纸后化学法和免疫法检测结果
五、免疫法的钩状效应试验

对1例TMB试纸FOBT强阳性的样本进行一系列稀释后作免疫法与化学法对比检测, 结果见表3。高浓度Hb样本免疫法呈现假阴性结果, 经过一定比例稀释后, 可以呈阳性结果。

表3 免疫法的钩状效应试验
六、初步临床试验

结果见表4。

表4 TMB试纸免疫法对健康者和各种疾病患者的检测结果[例数(%)]
讨 论

FOBT是临床上诊断和监测消化道出血性疾病的重要手段之一, 也是筛查消化道恶性肿瘤的简易、经济和有效的方法, 有助于降低结、直肠癌的病死率[4~6]。目前最常用的FOBT试剂为检测Hb的免疫法纸条, 虽在特异性方面优于以往应用的化学法, 特别是克服了化学法对某些食物出现假阳性的缺点。但免疫法在2种情况下会出现假阴性, 本研究显示当Hb浓度达到10 000 μ g/mL时免疫法的结果为阴性(见表2), 1例柏油样粪便样本稀释到1:30时结果仍为阴性(见表3)。另外如果上消化道出血, Hb经过胃蛋白酶和胰蛋白酶的消化, 会失去或改变其抗原性, 免疫反应阴性, 这亦在本研究中已得到印证(见表4), 而在这2种情况下, 化学法仍保持阳性结果。因此化学法与免疫法FOBT联用可以弥补免疫法漏检消化道出血的可能性, 特别在大批量筛查时, 受检者作好测试前准备, 本法不失为一种敏感性高、稳定性好、方法简便、成本低廉的好方法, 所附的质控品亦可兼用于免疫法试条, 值得推荐与免疫法联用以弥补免疫法之不足。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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