引用本文
缪怡, 徐雪亮, 金洁美, 李水军, 沈博. 变异血红蛋白对2种基于HPLC原理的糖化血红蛋白检测系统的影响. 2009, 24(4): 251-254
MIAO Yi, XU Xueliang, JIN Jiemei, LI Shuijun, SHEN Bo. Effect of hemoglobin variants on the derermination of glycohemoglobin by two high performance liquid chromatography-based methods. Labratory Medicine, 2009, 24(4): 251-254  
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变异血红蛋白对2种基于HPLC原理的糖化血红蛋白检测系统的影响
缪怡1, 徐雪亮2, 金洁美1, 李水军1, 沈博1
1.上海市徐汇区中心医院中心实验室,上海 200031
2.上海市长宁区光华医院检验科,上海 200052

作者简介:缪 怡,女,1976年生,学士,主管技师,主要从事临床化学检验研究。

摘要
目的

比较亲和层析-高效液相色谱(AC-HPLC)系统和离子交换-高效液相色谱(IE-HPLC)系统测定血红蛋白(Hb)结构不同的血液样本中HbAlc的结果,评价变异Hb对2种检测系统的影响。

方法

分别用2种HPLC系统同时检测HbA1c含量在5%~11%、Hb结构正常的血液样本和含有不同浓度胎儿Hb(HbF)的血液样本以及α-地中海贫血(α-MA)和β-地中海贫血(β-MA)患者血液样本中的HbA1c浓度。

结果

对于Hb结构正常、HbA1c含量在5%~11%的血液样本,2种HPLC检测系统的测定结果差异无统计学意义( P>0.05)。AC-HPLC法不受血液样本中HbF的干扰;若血液样本中HbF的含量超过8.8%,IE-HPLC法测定结果存在一定的偏倚,当HbF含量达70% 时甚至无法测出结果。对于α-MA和轻型β-MA患者的血液样本,IE-HPLC法的结果明显高于AC-HPLC法( P<0.01、 P<0.05),而重型β-MA患者的样本用IE-HPLC法甚至无法测得结果。

结论

用IE-HPLC法检测含变异Hb、HbF的样本中的HbA1c,结果可能受干扰;而用AC-HPLC法则不受干扰。

关键词: 糖化血红蛋白; 变异血红蛋白; 离子交换-高效液相色谱; 亲和层析-高效液相色谱
中图分类号:R446.1 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2009)04-0251-04
Effect of hemoglobin variants on the derermination of glycohemoglobin by two high performance liquid chromatography-based methods
MIAO Yi1, XU Xueliang2, JIN Jiemei1, LI Shuijun1, SHEN Bo1
1.Central Laboratory,Shanghai Xuhui Central Hospital,Shanghai 200031,China
2. Department of Clinical Laboratory,Shanghai Changning Central Guanghua Hospital,Shanghai 200052,China
Abstract
Objective

To compare the results of HbAlc in blood samples with various configuration of hemoglobin(Hb) by affinity chromatogragh-high performance liquid chromatography(AC-HPLC)system and ion exchange-high performance liquid chromatography (IE-HPLC)system,and evaluate the effect of glycohemoglobin variants on AC-HPLC and IE-HPLC.

Methods

The levels of HbA1c in 30 blood samples with the normal Hb configuration and the HbA1c levels were 5%-11%,the blood samples with different HbF levels and the blood samples of patients with α-Mediterranean anemia (α-MA)and β-Mediterranean anemia (β-MA) were determined by AC-HPLC and IE-HPLC,respectively.

Results

There was not difference between the AC-HPLC and IE-HPLC for the blood sanples with normal Hb configuration and the HbA1c levels were 5%-11%( P>0.05). There was not interference with HbF for HbA1c determation by AC-HPLC. However,the bias of HbA1c determination by IE-HPLC was occurred when HbF level >8.8%,and the HbA1c was undetectable when HbF level was 70%. For blood samples with patients with α-MA and mitis β-MA,the results of HbA1c deteremind by IE-HPLC were significantly higher than AC-HPLC( P<0.01 and P<0.05,respectively). The level of HbA1c in patient with gravis type β-MA was undetected by IE-HPLC.

Conclusions

The results of HbA1c in blood samples containing Hb variants or HbF may be interfered when analyzed by IE-HPL. However,there was not interferences with AC-HPLC.

Keyword: Glycohemoglobin; Hemoglobin variants; Ion exchange-high performance liquid chromatography; Affinity chromatogragh-high performance liquid chromatography

临床实验室测定糖化血红蛋白(glycohemoglobin, GHb)大多依据其物理、化学或与抗体结合的相关特性进行测定, 而体内的胎儿血红蛋白(HbF)、变异血红蛋白(Hb)和Hb衍生物往往对GHb的测定有一定的干扰。我们试用亲和层析(affinity chromatogragh, AC)原理的高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)系统(AC-HPLC)和离子交换(ion exchange, IE)原理的HPLC系统(IE-HPLC)分别测定Hb结构正常的糖尿病患者血液样本、含有不同浓度的HbF血液样本以及α -地中海贫血(α -mediterranean anemia, α -MA)和β -地中海贫血(β -mediterranean anemia, β -MA)患者血液样本中的HbA1c。通过结果的比对分析, 评价2种不同检测原理的HPLC系统在GHb检测中的检测性能[2]以及不同结构的Hb对结果的影响。

材料和方法
一、材料

1. 样本 分别选取HbA1c含量在5% ~ 11%、Hb结构正常的静脉血液样本30份; 新生儿脐带血1份, α -MA患者5例(轻型4例, HbH病1例)和β -MA患者5例(轻型4例, 重型1例)。α -MA和β -MA血液样本由广州市第一人民医院和广州金域体检中心提供并做分型鉴定。

2. 仪器和试剂 Primus PDQ AC-HPLC检测系统及配套试剂; Bio-Rad D-10 IE-HPLC检测系统及配套试剂。

二、方法

1.原理 Primus PDQ AC-HPLC系统是基于葡萄糖和血红蛋白稳定结合后都会产生顺位二醇(cis-diol)官能基团, 后者能与硼酸盐特异性结合的原理, 达到分离测定的目的。Bio-Rad D-10 IE-HPLC系统的检测原理是基于HbA1c与其他Hb电荷的不同对HbA1c进行分离[3]。

2.不同浓度HbF的制备 将新生儿脐带血液样本(HbF含量约为70%[4])与糖尿病患者血液样本(用2种HPLC方法测得HbA1c的含量平均值为9.1%)按1:9混合, 使混合样本HbF含量约为7%。用2种HPLC方法同时检测混合样本的HbA1c含量, 取均值为8.57%。从而计算出新生儿脐带血液样本中HbA1c的含量约为3.8%。将新生儿脐带血液样本作为1号样本, 再用上述糖尿病患者血液样本分别对新生儿脐带血液样本作2、4、8、16倍稀释, 分别作为2~5号样本。以新生儿脐带血的HbF含量为70.0%计算, 1~5号样本的HbF的理论含量分别为70.0%、35.0%、17.5%、8.8%和4.4%, 其HbA1c的理论含量分别为3.8%、6.5%、7.8%、8.4%和8.8%。分别使用2种HPLC检测系统测定1~5号样本中HbA1c的含量, 每个样本重复3次取平均值, 并按国际要求3%的CV值计算可信检测范围。

三、统计学方法

使用SPSS11.5统计软件作配对计量资料的t检验及回归分析。

结 果
一、HbA1c含量在5.0%~11.0%、Hb结构正常的血液样本的测定

分别用AC-HPLC和IE-HPLC测定30份HbA1c含量在5.0%~11.0%、Hb结构正常的血液样本。以IE-HPLC测定结果为Y, AC-HPLC测定结果为X, 对30份血液样本的测定结果进行回归分析, 方程为Y = 1.007 X + 0.10, r=0.996, P< 0.001。对于Hb结构正常的各种浓度HbA1c的血液样本, 2种HPLC检测系统的测定结果差异无统计学意义(P> 0.05)。

二、不同浓度的HbF对2种HPLC检测系统测定HbA1c的影响。

AC-HPLC的检测结果不受HbF的干扰, 都在可信检测范围内。对于IE-HPLC, 当HbF< 8.8%时, 测定结果与预期值无差异; 当样本中HbF的含量为8.8%~35.0%时, 其测定结果要高于HbA1c的理论含量, 平均偏倚为2.36%; 当HbF含量高达70%时平均偏倚高达8.00%, 甚至无法检测出结果。见表1。

表1 不同浓度HbF对2种HPLC检测系统测定HbA1c的影响(%)
三、2种HPLC系统测定α -MA、β -MA患者血液样本中的HbA1c

对于α -MA患者的血液样本, 用IE-HPLC测定的结果明显高于AC-HPLC(P< 0.01); 而对于β -MA患者的血液样本, 2种检测系统的测定结果与β -MA的轻重有关。在轻型β -MA患者中, 用IE-HPLC测定的结果明显高于AC-HPLC(P< 0.05), 在重型β -MA患者中(β 0纯合子)用IE-HPLC法甚至无法测得结果。见表2。

表2 2种HPLC系统测定α -MA及β -MA患者HbA1c结果(%)
讨 论

在健康成人中, 正常Hb由97%的HbA(α 2β 2)、2.5% 的HbA2(α 2γ 2)和0.5%的HbF(α 2δ 2)组成。异常Hb主要源自变异Hb和珠蛋白生成障碍。前者主要是由于Hb α 、β 、γ 链上的点突变而引起Hb氨基酸序列的改变, 最常见的变异Hb是HbS(Hb α 2 β26Glu→Val)(镰状细胞贫血症)、HbC(Hb α 2 β26Glu→Lys)和HbE (Hb α 2 β226Glu→Lys); 后者是由于珠蛋白基因的缺失或缺陷引起Hb珠蛋白肽链中合成的不平衡, 可分为α -MA和β -MA[5]。

本研究选用2种原理的HPLC检测系统来分别测定各组血液样本中的GHb含量。对于Hb结构正常的各种浓度HbA1c的血液样本, 2种HPLC检测系统的测定结果有显著的相关性。但IE-HPLC在HbF浓度达70%时, 无法获得检测结果; HbF浓度在8.8%~35.0%时, 结果高于预期值; HbF浓度低于8.8%时, 结果与预期值有很好的相关性。这是由于HbF实际上是一种Schiff碱, 所带电荷与HbA1c相似, 在测定时两峰可能出现部分或完全重叠。当样本中含有大量浓度的HbF时, 出峰时间大大延长, 无法在既定时间内对各种Hb进行分离; 当HbF浓度在8.8%~35.0%时, 部分HbF会被当做HbA1c被洗脱, 而计入HbA1c, 使IE-HPLC的计算公式HbA1c/(HbA1c + HbA)的值变大, 导致结果高于预期值, 而在HbF浓度较低时两峰重叠部分可能较小, 对计算结果影响可能不大[6]。本研究结果显示AC-HPLC的测定结果不受HbF的干扰, 都在可信检测范围内。

很多Hb病, 包括镰状细胞病HbS、纯合子HbC病、HbSC病和α -MA, 常常会引起次要Hb类(如HbA2和HbF)的值升高, 通常HbF的浓度从2%~20%不等[8]。本研究分别用2种HPLC系统测定α -MA和β -MA患者的HbA1c, 发现对于α -MA和轻型β -MA患者, IE-HPLC的结果要明显高于AC-HPLC, 而重型β -MA患者(β 0纯合子)的样本用IE-HPLC测得则无法结果。这可能与β -MA患者样本中HbF的浓度高低有关[7]。AC-HPLC的测定结果未见这一干扰现象。

本研究结果提示, AC-HPLC测定HbA1c具有不受HbF、变异Hb干扰的优点。在1999年美国调查临床实验室所使用的GHb测定方法, 结果显示参与调查的临床实验室有超过一半使用硼酸盐AC-HPLC, 约30%使用IE-HPLC, 约15%使用免疫方法, 而< 5%使用电泳方法[8]。有资料显示在美国约1 600万糖尿病患者中有超过15万的患者体内含有变异Hb[9], 因而在分析糖尿病患者GHb测定结果时须考虑测定方法对其的影响。

国际临床化学联合会(IFCC)确立的测定HbA1c的参考方法是高效液相-电喷物电离/质谱(HPLC-ESI/MS)或高效液相-毛细管电泳(HPLC-CE/UV) [10]。国内临床检验的主管部门也提倡重视GHb测定技术及量值溯源[11]。在后续的研究中, 我们将以LC-MS/MS质谱法为参考, 对AC-HPLC和IE-HPLC测定HbA1c作进一步的比对研究。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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