引用本文
史伟峰, 王玉月, 李美忠, 周军. 产超广谱β-内酰胺酶的肺炎克雷伯菌相关耐药基因研究. 2009, 24(3): 215-218
SHI Weifeng, WANG Yuyue, LI Meizhong, ZHOU Jun. Study on the drug-resistant genes associated with extended-spectrum beta-lactamases in Klebsiella pneumoniae . Labratory Medicine, 2009, 24(3): 215-218  
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产超广谱β-内酰胺酶的肺炎克雷伯菌相关耐药基因研究
史伟峰, 王玉月, 李美忠, 周军
苏州大学附属第三医院检验科,江苏 常州 213003

作者简介:史伟峰,男,1967年生,硕士,主任技师,主要从事临床微生物学、免疫学研究。

摘要
目的

了解常州地区肺炎克雷伯菌耐药状况及β-内酰胺类耐药基因。

方法

用琼脂稀释法检测氨苄西林、哌拉西林、哌拉西林-他唑巴坦、头孢噻肟、头孢他啶、头孢吡肟、氨曲南和亚胺培南对肺炎克雷伯菌的最低抑菌浓度(MIC)。采用聚合酶链反应(PCR)检测产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)肺炎克雷伯菌16种相关耐药基因,并用DNA测序仪测序。

结果

120株肺炎克雷伯菌ESBLs阳性率为44.2%(53株)。从53株肺炎克雷伯菌中检出TEM、SHV、CTX-M-1群、CTX-M-9群、OXA-1群、LEN、OKP和DHA 8种β-内酰胺酶基因,阳性率分别为75.5%、22.6%、18.9%、7.5%、11.3%、5.7%、3.8%和41.5%,其中2株菌同时检出6种β-内酰胺酶基因。基因测序证实为TEM-1、TEM-11、SHV-13、SHV-28、CTX-M-22、CTX-M-55、OXA-1和OKP-6等。

结论

本地区肺炎克雷伯菌已携带多种β-内酰胺酶耐药基因,是其对β-内酰胺类抗菌药物耐药的重要原因之一。

关键词: 肺炎克雷伯菌; β-内酰胺酶; 耐药基因
中图分类号:R378.99 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2009)03-0215-04
Study on the drug-resistant genes associated with extended-spectrum beta-lactamases in Klebsiella pneumoniae
SHI Weifeng, WANG Yuyue, LI Meizhong, ZHOU Jun
Department of Clinical Laboratory,the Third Affiliated Hospital of Suzhou University, Jiangsu Changzhou 213003,China
Abstract
Objective

To investigate the resistance to antimicrobials and resistant genes associated with beta-lactams in Klebsiella pneumoniae ( K.pneumoniae) isolated from Changzhou district.

Methods

Minimum inhibitory concentrations(MIC) of ampicillin,piperacillin, piperacillin-tazobactam,cefotaxime, ceftazidime, cefepime,aztreonam and imipenem were determined by agar dilution method. Sixteen resistant genes of K.pneumoniae producing extended-spectrum beta-lactamases (ESBLs) were detected by polymerase chain reaction (PCR) amplification and sequenced by DNA sequencer.

Results

The detecting rate of ESBLs in 120 isolates of K. pneumoniae was 44.2%(53/120). Eight beta-lactamase resistant genes including TEM,SHV,CTX-M-1 group,CTX-M-9 group,OXA-1group,LEN,OKP and DHA in 53 isolates were found,and their positive rates were 75.5%,23.6%,18.9%,7.5%, 11.3%,5.7%,3.8% and 41.5%,respectively.However,6 beta-lactamase resistant genes were simultaneously isolated from 2 isolates.It was also demostrated that TEM-1, TEM-11, SHV-13, SHV-28,CTX-M-22,CTX-M-55,OXA-1 and OKP-6 were identical to sequence in Genbank gene.

Conclusions

K. pneumoniae have carried various kinds of β-lactamase resistant genes in Changzhou district. It becomes one of important causes resistant to beta-lactam antimicrobials.

Keyword: Klebsiella pneumoniae; Beta-lactamase; Resistant gene

肺炎克雷伯菌是临床最常见的条件致病菌之一, 分离率仅次于大肠埃希菌。肺炎克雷伯菌所致医院感染中以泌尿道感染、呼吸道感染、菌血症等最为常见。2002年1月至12月国家细菌耐药监测网对8个省、市自治区的57家三级甲等医院进行调查, 肺炎克雷伯菌列第3位, 占8.2%[1]。近年来肺炎克雷伯菌耐药率不断增加, 给临床治疗带来极大困难。肺炎克雷伯菌可产生多种β -内酰胺酶(如TEM、SHV、OXA等)、质粒型AmpC酶(如DHA), 是其对β -内酰胺类抗菌药物耐药的主要机制[2~5]。为了解常州地区临床分离的肺炎克雷伯菌β -内酰胺类抗菌药物耐药基因及分子流行病学, 我们检测了120株肺炎克雷伯菌的超广谱β -内酰胺酶(ESBLs), 并用分子生物学技术研究了16种β -内酰胺类抗菌药物耐药相关基因。

材料和方法
一、材料

1. 菌株来源 2006年1月至2006年12月从苏州大学附属第三医院住院患者痰液、尿液、血液、脓液、腹水等标本中分离出120株肺炎克雷伯菌。

2. 抗菌药物 氨苄西林、哌拉西林、哌拉西林-他唑巴坦、头孢噻肟、头孢他啶、头孢吡肟、氨曲南和亚胺培南均购自北京生物制品检定所。

3. 仪器 Bactec 9120血培养仪、Phoenix100全自动细菌鉴定药敏系统均为美国BD公司产品。PCR扩增仪和ABI377基因测序仪为美国PE公司产品。

二、方法

1.细菌鉴定和药敏试验 挑取经水解酪蛋白胨(MH)琼脂纯培养的若干菌落在PhoenixTM-100鉴定肉汤中调节浊度制成0.5~0.6麦氏单位的菌液, 接种至革兰阴性鉴定/药敏板中, 放入仪器内35 ℃连续检测, ESBLs按美国临床实验室标准化研究所(CLSI)规则判定。8种β -内酰胺类抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC)采用CLSI琼脂稀释法标准测定。质控菌株:大肠埃希菌(ATCC 25922)和肺炎克雷伯菌(ATCC 700603)。

2.DNA的抽提 蛋白酶K消化法。

3.基因PCR扩增 根据基因库中核苷酸序列自行设计引物, 用单一聚合酶链反应(PCR)扩增基因, 见表1。PCR扩增反应如下:93 ℃预变性3 min后, 93 ℃变性1 min, 55 ℃退火1 min, 72 ℃延伸5 min, 共进行35次循环, 20 μ L PCR产物上样经2%琼脂糖凝胶电泳, 溴化乙啶(EB)染色, 观察结果并拍照保存。

4.基因序列分析 PCR产物纯化后, 由上海生物工程公司使用ABI 377 DNA 测序仪测序, 测得序列用基因库中的Blast程序进行同源分析。

表1 PCR引物序列
结 果
一、药敏试验结果

从120株肺炎克雷伯菌中检出53株产ESBLs菌, 阳性率为44.2%。53株肺炎克雷伯菌对青霉素类、头孢菌素类抗菌药物的耐药性很强。氨苄西林、哌拉西林、哌拉西林-他唑巴坦、头孢噻肟、头孢他啶、头孢吡肟、氨曲南的MIC50均> 64 μ g/mL, 亚胺培南对肺炎克雷伯菌仍有极强的抗菌活性, MIC50仅为0.062 5 μ g/mL。见表2。

表2 抗菌药物对53株肺炎克雷伯菌的MIC(μ g/mL)
二、β -内酰胺酶基因检测结果

53株肺炎克雷伯菌检出TEM、SHV、CTX-M-1群、CTX-M-9群、OXA-1群、LEN、OKP和DHA 8种β -内酰胺酶基因, 阳性率分别为75.5%、22.6%、18.9%、7.5%、11.3%、5.7%、3.8%和41.5%, 除CTX-M-9群和DHA外, 其余6种基因序列比对分析结果见表3。53株肺炎克雷伯菌中有49株至少检出1种β -内酰胺酶基因, 29株同时检出2种以上β -内酰胺酶基因, 2株菌最多同时检出6种β -内酰胺酶基因, 只有4株菌没有检出β -内酰胺酶基因。TEM、DHA基因PCR电泳图见图1、2。

表3 53株肺炎克雷伯菌β -内酰胺酶基因序列比对结果

图1 blaTEM基因PCR电泳图

图2 blaDHA基因PCR电泳图

讨 论

在革兰阴性杆菌中产生β -内酰胺酶是其对β -内酰胺类抗菌药物耐药的主要原因。按照水解底物能力不同, β -内酰胺酶可分为3类:普通β -内酰胺酶、ESBLs和金属β -内酰胺酶[6]。近几年来, 随着广谱β -内酰胺类抗菌药物的广泛应用和不合理使用, ESBLs菌株发生率逐年提高, 并不时出现爆发流行。ESBLs由质粒介导, 能水解氧亚氨基头孢菌素和氨曲南, 可被β -内酰胺酶抑制剂(克拉维酸等)所抑制[7]。

革兰阴性菌中第1种质粒介导的β -内酰胺酶TEM-1在1960年初被报道。TEM-1酶最初是从希腊一位名叫Temoniera患者的血培养中分离的一株大肠埃希菌中发现, 因而命名为TEM。其由质粒和转座子介导, 促进了TEM在同种或异种细菌间的传播 [8]。在随后的几年内, TEM β -内酰胺酶播散到全球, 现已成为肠杆菌科、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌和淋病奈瑟菌等细菌常见的β -内酰胺酶[9]。大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中常见的质粒介导的β -内酰胺酶是SHV-1, 大多数肺炎克雷伯菌产生的SHV-1酶由染色体编码, 而大肠埃希菌的SHV-1酶常由质粒介导[10]。一种新的β -内酰胺类抗菌药物应用临床不久, 很快就出现了耐药, 主要原因是细菌产生了新的β -内酰胺酶。此外, CTX-M和OXA类酶等介导的耐药也在逐年增多。本研究53株肺炎克雷伯菌检出TEM、SHV、CTX-M-1群、CTX-M-9群、OXA-1群、LEN、OKP和DHA 8种β -内酰胺酶基因, 阳性率分别为75.5%、22.6%、18.9%、7.5%、11.3%、5.7%、3.8%和41.5%。53株肺炎克雷伯菌中有49株至少检出1种β -内酰胺酶基因, 2株菌最多同时检出6种β -内酰胺酶基因。

产ESBLs菌株不仅对青霉素类、头孢菌素类耐药, 而且对氟喹诺酮类、氨基糖苷类、磺胺类存在严重的交叉耐药, 产ESBLs菌可以通过接合、转化和转导等形式在同种或异种细菌间传播耐药基因, 从而造成医院严重的交叉感染[11, 12]。53株肺炎克雷伯菌对青霉素类、头孢菌素类抗菌药物的耐药性很强。氨苄西林、哌拉西林、哌拉西林-他唑巴坦、头孢噻肟、头孢他啶、头孢吡肟、氨曲南的MIC50均> 64 μ g/mL, 亚胺培南对肺炎克雷伯菌仍有极强的抗菌活性, 其MIC50仅为0.062 5 μ g/mL。因此应加强对院内感染菌株耐药性监测, 研究耐药基因分子流行病学规律, 切断耐药质粒传播途径, 严格控制抗菌药物使用, 降低院内感染的发生率。

The authors have declared that no competing interests exist.

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