引用本文
肖敏敏, 黄升海, 陈健康, 吴同生. 三种方法检测乙型肝炎YMDD变异的比较研究及临床结果分析. 2009, 24(3): 173-176
XIAO Minmin, HUANG Shenghai, CHEN Jiankang, WU Tongsheng. Compurative studies on detection of YMDD mutation in hepatitis B virus by three methods and their clinical results. Labratory Medicine, 2009, 24(3): 173-176  
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三种方法检测乙型肝炎YMDD变异的比较研究及临床结果分析
肖敏敏1, 黄升海2, 陈健康1, 吴同生3
1. 安徽省芜湖市第二人民医院,安徽 芜湖 241001
2. 安徽医科大学微生物教研室,安徽 合肥 230032
3. 安徽省铜陵市人民医院, 安徽 铜陵 244000

作者简介:肖敏敏,女,1974年生,硕士,主管技师,主要从事分子生物学检验。

摘要
目的

对检测乙型肝炎病毒(HBV)YMDD变异的3种方法进行灵敏度和特异性比较,并结合患者治疗前HBV DNA载量、丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平免疫标志物和YMDD变异后HBV DNA载量等临床信息进行结果分析。

方法

分别以荧光定量PCR(FQ-PCR)、通用模板信号扩增PCR(UT-PCR)和聚合酶链反应微板核酸杂交-酶联免疫吸附法(PCRmnh-ELISA),对拉米夫定治疗过程中血清出现HBV DNA由阴转阳的52例慢性乙型肝炎患者,进行HBV YMDD变异检测,比较3种方法的敏感性,并对3种方法检测结果不一致的标本进行测序,比较他们的特异性。

结果

FQ-PCR、UT-PCR和PCRmnh-ELISA对YMDD变异的检出率分别为:53.85%、48.08%、73.07%,FQ-PCR和UT-PCR均与PCRmnh-ELISA差异有统计学意义( P<0.05),FQ-PCR与UT-PCR差异无统计学意义( P>0.1)。检测结果不一致的17例标本进行了测序,FQ-PCR、UT-PCR、PCRmnh-ELISA与检测结果的符合率分别为94.1%、70.6%、29.4%,3者之间差异有统计学意义( P<0.05)。

结论

3种方法比较,FQ-PCR检测HBV YMDD变异具有较高的灵敏性和特异性,并能同时检测出野生株和变异的混合感染,与测序结果相符,是诊断HBV YMDD变异较好的方法。

关键词: 乙型肝炎病毒; YMDD变异; FQ-PCR; UT-PCR; PCRmnh-ELISA
中图分类号:R512.6 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2009)03-0173-04
Compurative studies on detection of YMDD mutation in hepatitis B virus by three methods and their clinical results
XIAO Minmin1, HUANG Shenghai2, CHEN Jiankang1, WU Tongsheng3
1.The Second people's Hospital of Wuhu,Anhui 241001,China
2.Depairtment,of Microbiology,Anhui Medial University,Anhui Hefei 230032,China
3.The First People's Hospital of Tonglin,Anhui Tonglin 244000,China
Abstract
Objective

To compare the sensitivity and specificity of three methods used to detect YMDD mutation in hepatitis B virus(HBV),and to analyse the detection results combined with HBV DNA,alanine aminotransferase (ALT) levels,serum markers vefote and after treatment.

Methods

The sensitivity and specificity of fluorescence quantitative polymerase chain reaction (FQ-PCR )and signal universal template polymerase chain reaction (UT-PCR) were compared with those of polymerase chain reaction microplate hybridization enzyme-linked immunosorbent assay (PCRmnh-ELISA) through detection of HBV YMDD mutation in 52 serums from chronic hepatitis B patients rceiving lamivudine monotherapy at the time of viral breakthrough.The inconsistent samples detected by three methods were sequenced.

Results

The rates of HBV YMDD mutation detected by FQ-PCR,UT-PCR and PCRmnh-ELISA were 53.85%,48.08% and 73.07%,respectively.There were significant differences between FQ-PCR and PCRmnh-ELISA,UT-PCR and PCRmnh-ELISA ( P<0.05).However,there was not significant difference between FQ-PCR and UT-PCR ( P>0.1).The rates of consistency with sequencing in 17 samples were 94.1% by FQ-PCR,70.6% by UT-PCR and 29.4% by PCRmnh-ELISA,respectively,and there were significant differeces among them ( P<0.05).

Conclusions

FQ-PCR is a very good approach for detect ion of HBV YMDD mutations due to the higher sensitivity and specificity,and for the detection of coinfection of wild type and YMDD mutations.

Keyword: Hepatitis B; YMDD mutation; Fluorescence quantitative polymerase chain reaction; Signal universal template polymerase chain reaction; Polymerase chain reaction microplate hybridization-enzyme-linked immunosorbent assay

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)威胁着全世界人民的健康[1], 60%~80%的肝硬化和肝细胞癌为慢性乙型肝炎(乙肝)患者。乙肝患者长期使用拉米夫定, 可导致的病毒DNA突变达20多种, 目前比较明确与耐药相关的主要是HBV多聚酶活性YMDD基因序列的变异。为探讨HBV YMDD变异检测的方法及临床应用研究价值, 我们采用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)、通用模板信号扩增PCR(UT-PCR)和聚合酶链反应微板核酸杂交-酶联免疫吸附法(PCRmnh-ELISA) 3 种检测方法, 对拉米夫定治疗过程中HBV-DNA由阴转阳性的52例慢性乙肝患者进行了HBV YMDD变异检测 , 同时分析拉米夫定治疗乙肝过程中出现的YMDD变异状况及相关临床结果。

材料和方法
一、研究对象

2005年1月至2007年3月在铜陵市人民医院感染科门诊及住院的接受拉米夫定治疗的52例慢性乙肝患者, 其中男32例, 女20例, 年龄12~76岁, 所有病例血清HBV DNA和乙型肝炎表面抗原(HBsAg)均为阳性, 诊断符合2000年第10次全国病毒性肝炎与肝病学术会议制定的诊断标准。患者口服拉米夫定100 mg/d。未接受其他抗病毒和免疫调节剂治疗。患者在治疗前以及治疗开始后每月采集静脉血, 1 h内分离血清, 其中生化指标每月检测1次, HBV免疫标志物、HBV DNA载量每3个月检测1次, 对出现HBV DNA “ 反跳” 的患者血清检测YMDD变异。

二、仪器方法

免疫标志物测定采用酶联免疫吸附试验, 试剂盒为北京万泰生物药业有限公司产品。丙氨酸氨基转移酶(ALT)采用速率法(日立7170全自动生化仪进行检测), 参考值为< 40 IU/L。HBV DNA定量检测采用聚合酶链反应(深圳匹基公司试剂盒)。YMDD变异用FQ-PCR、UT-PCR、PCRmnh-ELISA 3种方法检测, 试剂盒分别来自杭州博赛基因诊断技术有限公司、上海复星生物技术有限公司、上海浩源生物科技有限公司。DNA测序由之江生物科技有限公司完成。

三、统计学方法

所有数据在计算机上录入后用国际标准统计软件包SAS 6.12软件进行统计, 数据均以 x̅± s表示, 组间比较用t检验。

结 果
一、YMDD变异株检出率的比较

52例血清标本中, FQ-PCR法检出变异株28例, 检出率为53.85%, 其中2例是野生型与变异株共存。FQ-PCR法检出YMDD变异株为25例, 检出率为48.08%, 其中5例为I/V 2种变异共存, 16例为YIDD变异, 4例为YVDD变异。PCRmnh-ELISA法检测出38例变异株, 检出率为73.08%。结果见表1。

表1 3种方法检测52例血清标本HBV YMDD变异检出率比较
二、3种方法与测序法的符合率比较

对3种检测方法结果不一致的17例标本进行测序分析, 测序结果为野生型11例, 变异型5例, 混合型1例。3种方法与测序结果的符合率比较见表2。

表2 3种方法与测序检测结果符合率比较
三、YIDD和YVDD的检测结果

FQ-PCR、UT-PCR、PCRmnh-ELISA 3种方法中, 只有UT-PCR能具体检测出YIDD和YVDD变异株, 结合测序结果可知52例血清标本28例为YMDD变异株, 其中17例YIDD变异, 7例YVDD变异, 3例YI/VDD混合变异, 1例YM/I/VDD混合变异。

四、YMDD变异与治疗前HBV DNA及ALT水平分析

YMDD野生组治疗前的HBV DNA水平为(100.19± 99.95)× 106拷贝/mL, 2组差异无统计学意义(t=0.006, P> 0.05)。28例YMDD变异组治疗前有26例ALT水平异常, 在拉米夫定治疗后恢复正常, 后又出现反弹, 但基本低于治疗前水平。24例YMDD无变异者有6例ALT水平异常, 在拉米夫定治疗后恢复正常, 以后一直维持在正常范围内。YMDD野生组治疗前的ALT水平为(34± 17)U/L, YMDD变异组为(83± 45)U/L, 2组差异有统计学意义(t=6.91, P< 0.01), YMDD变异组ALT 基础水平高于YMDD野生组, 说明治疗前高水平ALT的慢性乙肝患者发生YMDD变异的可能性大于低水平患者。

五、YMDD变异后HBV DNA水平变化

发生YIDD变异的17例患者治疗前HBV DNA平均水平为1.58× 107拷贝/mL, 变异后HBV DNA水平显著降低, 平均为5.63× 105拷贝/mL(t=2.17, P< 0.05); 发生YVDD变异的7例患者治疗前HBV DNA平均水平为1.89× 107拷贝/mL, 变异后HBV DNA 水平降低, 平均为1.78× 106拷贝/mL 2者差异无统计学意义(t=2.02, P> 0.05)。7例患者发生YVDD变异后的HBV DNA水平与17例发生YIDD变异后HBV DNA 水平差异无统计学意义(t=1.92, P> 0.05)。

六、YMDD变异与血清标志物关系

YMDD野生株患者治疗前HBeAg阳性率为36.0%(9/25), 变异株患者为39.3%(11/28), 2者比较差异无统计学意义(χ 2=0.06, P> 0.05), 说明大三阳乙肝患者发生YMDD变异的倾向并不比其他免疫类型患者大。

讨 论

HBV YMDD基序即酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸序列, 位于HBV聚合酶RT区的C区, 是HBV 逆转录酶的活性部分, 属高度保守序列, 在病毒DNA合成及反转录中起重要作用。多数专家[2]认为拉米夫定治疗前, 患者体内即存在变异株和野生株, 变异株的复制能力大大低于野生株, 当使用拉米夫定治疗时, 野生株复制被抑制, 而变异株成为优势株, 随疗程延长, 变异率呈上升趋势, 常见的变异有YIDD变异和YVDD变异2种形式。

本研究FQ-PCR法采用了Taqman-MGB双探针技术, 1个PCR扩增子, 2条荧光探针, 1条探针针对HBV保守区, 6-羧基荧光素(FAM)荧光素作为报道基因, 另1条探针针对YMDD核酸序列, 六氯-6-甲基荧光素(VIC)荧光素作为报道基因, MGB 是个3肽, 其可以结合在DNA双螺旋的小沟里, 起到稳定DNA双螺旋的作用。同常规Taqman探针相比, Taqman-MGB双探针的荧光本底更低, 分辨率更高, 杂交特异性更强, 探针长度也较短。此法不仅可以检测HBV YMDD野生株/变异株混合型, 还可以对HBV DNA进行定量。其检测敏感度和特异性均较高, 是适用于临床大规模推广的检测HBV YMDD的方法。

UT-PCR[3]采用通用模板和通用荧光探针的实时荧光PCR技术, 通用引物由5'端的通用模板(UT)序列和3'端的特异引物序列构成, 通用模板序列不与任何天然核酸序列相匹配, 只能与通用荧光探针匹配, 通用荧光探针5'端标以荧光发射基团FAM标记, 3'端以荧光淬灭基团TAMRA标记, 由于距离相近, 基团相互作用不产生荧光。UT-PCR具有高通量的特点, 且不需要特殊专用仪器, 就能够快速准确地检测出HBV耐药突变中临床最常见的YMDD变异, 并且能够与现在主流荧光实时PCR仪配合。就本研究所显示的结果来看, 尽管其灵敏度及特异度不及FQ-PCR法, 但其检测成本低, 且能鉴定变异类型, 不失为临床检测HBV YMDD的一个好方法。

PCRmnh-ELISA[4]是将基因扩增核酸杂交和酶联显色3种诊断技术融为一体的检测技术, 既解决了PCR产物的特异性检测, 又通过酶系统的放大作用提高了检测的灵敏度, 但其存在主要缺陷是较大的假阳性率。原因可能有:非特异性的探针杂交、扩增产物在移至微孔板的操作过程中被污染、过度敏感的酶放大系统等。此外, 寡核苷酸探针固相化技术不够成熟也是造成此法特异性低的一个原因。此法由于操作步骤复杂, 实验时间过长, 特异性不佳不适合临床常规应用。并且与FQ-PCR及UT-PCR扩增检测在一个密闭体系中相比, PCRmnh-ELISA无疑增加了对实验室的污染, 对实验室人员也造成威胁。

本研究中, YMDD突变后, HBV DNA水平显著降低, 其中YVDD变异株和YIDD变异株的HBV DNA水平未有显著差异, 这与汪小娟等[5]的研究结果YVDD变异株HBV DNA水平高于YIDD不符, 这一点需要在今后的工作中增加例数加以研究。52例血清标本中, YMDD变异株有28例, 其中17例YIDD变异, 7例YVDD变异, 3例YI/VDD混合变异, 1例YM/I/VDD混合变异, 显示慢性乙肝患者YIDD发生频率高于YVDD, 与文献报道相同[6]。在拉米夫定长期治疗过程中, 不同变异病毒可不断进化, 单一病毒株可变为优势病毒株。

YMDD野生株和变异株治疗前的HBV DNA水平差异无显著性, 而ALT水平差异有显著性, 说明ALT基础水平高可能是YMDD突变的易发因素, 这一点与张红河[7]的报道相似。但与王磊等[8]研究结果不符, 他们认为拉米夫定治疗慢性乙型患者, 基线ALT水平较低可作为YMDD变异发生的预测因子, 尚需通过增加病例等进一步研究。2003年拉米夫定临床应用专家组认为, 在拉米夫定治疗早期及以后治疗过程中都可能出现ALT升高或ALT复查后再次升高的现象, 原则上应分析ALT升高的各种具体原因, 动态观察ALT变化的同时, 继续使用拉米夫定, 并给予适当对症治疗。总之, 临床上要充分重视ALT指标的监测。

YMDD野生株和变异株治疗前HBeAg阳性率差异无统计学意义, 提示乙肝患者中较普遍的大三阳和小三阳患者, 其发生YMDD变异的几率可能无明显差异, 均需密切监控HBV DNA、ALT YMDD变异, 以尽可能及时了解变异状况, 调整治疗方案。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] Marrone A, Zampino R, Luongo G, et al. Low HBeAg serum levels correlate with the presence of the double A 1762T/G1764A core promoter mutation and a positive response to interferon on patients with chronic hepatitis B virus infection[J]. Intervirology, 2003, 46(4): 222-226. [本文引用:1]
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[5] 汪小娟, 刘香萍, 罗荛都, 等. 三种方法检测乙型肝炎病毒YMDD变异方法比较及结果分析[J]. 中国感染控制杂志, 2006, 5(2): 102-112. [本文引用:1]
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[7] 张红河, 张卫英, 陈岳明, 等. 多种方法研究乙型肝炎病毒多聚酶变异[J]. 中华肝脏病杂志, 2003, 11(7): 442-443. [本文引用:1]
[8] 王磊, 闫杰, 张照华, 等. 拉米夫定治疗慢性乙型肝炎患者YMDD变异及影响因素的研究[J]. 中华肝脏病杂志, 2004, 12(10): 585-590. [本文引用:1]