引用本文
王敏, 姜叶灵, 李先平. 慢性前列腺炎患者前列腺液细菌16S rRNA基因的检测. 2009, 24(3): 165-168
WANG Min, JIANG Yeling, LI Xianping. Detection of 16S ribosomal RNA gene of bacteria in prostatic secretion of patients with chronic prostatitis. Labratory Medicine, 2009, 24(3): 165-168  
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慢性前列腺炎患者前列腺液细菌16S rRNA基因的检测
王敏, 姜叶灵, 李先平
中南大学湘雅二医院检验科,湖南 长沙 410011

作者简介:王 敏,女,1976年生,硕士,主管技师,主要从事细菌耐药机制及抗感染研究。

摘要
目的

通过采用聚合酶链反应(PCR)技术对慢性前列腺炎患者前列腺液中细菌16S rRNA基因检测,探讨PCR方法诊断慢性前列腺炎细菌学病因的价值。

方法

收集102例慢性前列腺炎患者的前列腺液进行细菌培养,同时采用PCR法检测前列腺液中细菌16S rRNA基因,并测定和分析所得片段的DNA序列。对培养结果与PCR法检测结果进行了比较。

结果

102份前列腺液标本中,细菌培养法18例阳性,84例阴性,阳性率17.7%;PCR法71例阳性,31例阴性,阳性率69.6%。细菌培养法与PCR法检测结果比较,其差异有统计学意义( P<0.05﹚。测序结果显示DNA序列与GenBank公布的16S rRNA基因序列具有很高的同源性。

结论

PCR技术对慢性前列腺炎的临床诊断具有重要意义。

关键词: 慢性前列腺炎; 前列腺液; 16S rRNA基因; 聚合酶链反应
中图分类号:R697 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2009)03-0165-04
Detection of 16S ribosomal RNA gene of bacteria in prostatic secretion of patients with chronic prostatitis
WANG Min, JIANG Yeling, LI Xianping
Department of Clinical Laboratory, the Second Xiangya Hospital, Central South University, Hunan Changsha 410011,China
Abstract
Objective

To explore the role of bacteria in chronic prostatitis by detecting the bacterial 16S ribosomal RNA gene of the expressed prostatic secretion (EPS) using polymerase chain reaction (PCR).

Methods

EPS from 102 patients with chronic prostatitis were performed bacteria culture and analyzed by PCR for bacterial 16S ribosomal RNA gene. The DNA fragments were directly sequenced and compared with the 16S ribosomal RNA sequences reported in GenBank. At the same time, the results of two methods were compared.

Results

Among 102 EPS specimens, there were 18 positive and 84 negative analyzed by culture, and the positive rate of bacteria culture was17.7%. There were 71 positive in 16S ribosomal RNA gene and 31 negative analyzed by PCR, and the positive rate was 69.6%.There were significant difference between the result of bacteria culture and PCR( P<0.05).The DNA sequences had significantly homology with 16S ribosomal RNA gene.

Conclusions

PCR technique plays an important part in clinical diagnosis of chronic prostatitis.

Keyword: Chronic prostatitis; Prostatic secretion; 16S ribosomal RNA gene; Polymerase chain reaction

细菌感染是引起慢性前列腺炎的重要因素之一, 但是从传统的尿四杯培养法的结果来看, 其阳性率不高, 仅5%~10%。有关文献[1]报道, 到目前为止, 能够获得纯培养的微生物比例只有1%, 许多细菌还不能被常规的技术所检测。近年来随着基因诊断技术的发展, 其在临床上应用日趋广泛, 聚合酶链反应(PCR)技术诊断慢性前列腺炎已成为研究热点。我们收集102份前列腺液标本, 对其进行细菌培养同时用PCR法检测其16S rRNA基因, 将PCR法与细菌培养法结果进行比较, 以探讨PCR方法诊断慢性前列腺炎细菌学病因的价值。

材料和方法
一、检测对象

临床诊断为慢性前列腺炎患者共102例, 年龄16~73岁, 平均年龄33.6岁。诊断标准由临床提供:(1)尿频、尿急、尿痛, 尿道不适, 尿道滴白等泌尿系症状; (2)腰骶部、耻骨上区、腹股沟区、会阴部疼痛等; (3) 性功能紊乱; (4)精神心理异常如精神紧张、失眠、乏力、焦虑等; (5)直肠指诊前列腺表面不平或不对称, 或有硬结及压痛。具有以上1项或多项症状, 同时具有以下条件者诊断为慢性前列腺炎:(1)病程超过3个月; (2)前列腺液检查白细胞增加(白细胞> 10/HP), 卵磷脂小体减少或消失(卵磷脂< +++/HP)。

二、标本收集

由专人对患者尿道口进行局部消毒后, 按常规按摩法获取EPS, 一部分用于细菌培养, 一部分置-20℃备用。同时取20例正常人的前列腺液作为对照。

三、主要试剂及仪器

细菌培养基购自贝瑞特生物技术郑州有限公司; 生化鉴定试剂购自杭州天和微生物试剂有限公司; 细菌16S rRNA基因通用引物根据大肠埃希菌的DNA设计, 由上海英骏生物技术有限公司合成。上游引物(1 169bp~1 187bp):5'-CACTGGAACTGAGACAGGG-3'。下游引物(1 521bp~1 539bp):5'-AGGAGGTGATCCAACCGCA-3'。基因组DNA提取纯化试剂盒和DNA Marker I为北京天为时代科技有限公司产品; PCR反应所需试剂购自大连宝生物公司; PCR仪为法国生物梅里埃公司产品; 凝胶成像仪为美国Bio-Rad公司产品。

四、细菌培养

将送检标本分别划线接种于10%血琼脂平皿、巧克力平皿, 置37℃CO2温箱孵育18~24 h后观察, 取优势菌进行常规生化鉴定, 将细菌鉴定到种。

五、PCR检测前列腺液16S rRNA基因

严格按照说明书操作提取前列腺液中DNA。PCR反应体系(25 μ L):10× Taq Buffer(Mg2+ plus)2.5 μ L、dNTP(10 mmoL/L)2 μ L、上游引物(10 μ mmoL/L ), 下游引物(10 μ mmoL/L )各1.0 μ L、模板DNA(5 mmoL/L) 1μ L、Taq DNA聚合酶(5U/μ L)0.5μ L、双蒸水(ddH2O) 17μ L, 离心混匀后置PCR仪上进行自动化扩增反应。PCR反应步骤:94℃预变性5 min, 循环参数为94℃ 30 s, 50℃ 35 s, 72℃ 50 s, 循环35次后72℃ 10 min。产物分析:反应产物经20g/L%琼脂糖凝胶电泳, 电压为150V, 30 min后在紫外灯下观察结果。若在370 bp处有条带出现, 即判断为细菌感染阳性。

六、质量控制

为验证所用的16S rRNA基因通用引物对不同细菌DNA的通用性, 本实验将不同种类的细菌与标本(包括慢性前列腺炎患者以及作为阴性对照的健康成年男性的前列腺液)一起进行DNA提取及基因扩增, 电泳后观察结果。细菌由中南大学湘雅二医院检验科细菌室提供, 包括:金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性的葡萄球菌(Staphylococcus species coagulase-negative, CONS)、甲型溶血性链球菌、肺炎链球菌、屎肠球菌、粪肠球菌、大肠埃希菌、聚团肠杆菌、潘尼变形杆菌、阴沟杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌。

七、 测序及序列分析

取PCR产物送上海英骏生物技术有限公司测序部, 在ABI PRISM 3730全自动测序仪测序。用NCBI上的BLAST分析将测序结果与GenBank中的核苷酸序列进行同源性比较。

八、统计学方法

所得数据用SPSS 12.0软件包进行统计学处理, 采用χ 2检验。

结 果
一、细菌培养结果

102份前列腺液标本中, 细菌培养18例阳性, 84例阴性, 阳性率为17.65%。18例阳性标本的病原菌为:4例CONS, 3例大肠埃希菌, 2例甲型溶血性链球菌, 肺炎克雷伯菌、淋球菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌、普通变形杆菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、洛菲不动杆菌各1例。所有标本均为单一细菌感染。

二、扩增产物分析

取5 μ L扩增产物与1 μ L上样缓冲液混匀后点样于20 g/L琼脂糖凝胶(含0.5 μ g/mL溴化乙锭), 150 V电泳30 min后, 在紫外灯下观察结果并照相, 见图1与图2。可见16S rRNA基因扩增后出现1条约370 bp大小的DNA片段, 阴性对照为健康男性前列腺液16S基因扩增结果。

图1 PCR检测部分质控菌株的结果

图2 PCR检测部分标本的结果

三、PCR扩增产物测序

以PCR扩增产物为模板, 以PCR扩增的引物为引物, 由上海英骏生物技术有限公司进行序列测定, 共获338个核苷酸。与GenBank公布的16S rRNA基因序列(序列号AF078774)高度同源(score=611, 核苷酸同源性为95%)。

四、PCR法与培养法的比较

在18例前列腺液病原菌培养阳性标本中, PCR法阳性者15例, 阳性率为83.3%; 在培养法阴性的84例标本中, PCR法阳性者56例, 阳性率66.7%。对照标本PCR检测结果均为阴性。培养法和PCR法检测结果比较, 其差异有统计学意义(χ 2=47.61, P< 0.05), 见表1。

表1 培养法和PCR法检测结果对比情况
讨 论

按照美国国家健康研究所(NIH)的分类方法, 将慢性前列腺炎分为以下几型[2]:慢性细菌性前列腺炎(Ⅱ 型), 慢性非细菌性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征(Ⅲ 型), 无症状性炎症性前列腺炎(Ⅳ 型)。有资料[3]表明, 在102例慢性前列腺炎患者中, 慢性细菌性前列腺炎只占14%, 本次实验细菌培养阳性率为17.7%, 与以上结果相近, 表明细菌感染仍然是慢性前列腺炎的重要原因之一。虽然, 目前临床诊断细菌感染引起的慢性前列腺炎的主要方法为细菌培养, 但是细菌培养法比较费时, 并且阳性率较低, 使得部分患者不能得到及时有效的治疗, 因此, 该方法在临床应用上也有一定的局限性。

16S rRNA的基因存在于所有细菌的染色体上, 是由可变区和保守区交叉排列组成, 保守区序列在所有细菌菌种中高度一致, 而可变区序列则随菌种的不同有较大的变化[4]。本次实验所采用的细菌通用引物即是针对这一特点根据大肠埃希菌的16S rRNA基因保守序列设计而得。应用此通用引物对多种标准菌株进行PCR反应, 均得到了长度约370bp的DNA片段。为证实此PCR产物是否为特异性产物, 对2例标本的PCR产物进行序列测定, 其中1例为培养法阳性的CONS, 另1例为培养法阴性但PCR法阳性的标本。将测定的基因序列与已公布的16S rRNA基因序列比较, 结果显示两者核苷酸同源性高(Score≥ 50), 证实PCR产物为细菌的16S rRNA基因序列, 而不是非特异性产物。进一步表明培养法存在漏检, 培养法阴性不能排除细菌感染的情况。同时本次实验中的20例正常对照标本PCR检测结果均为阴性, 说明操作过程中标本污染的可能性小。

由于16S rRNA基因只在细菌中存在高度保守性, 而在病毒、真菌、支原体、衣原体以及人体细胞中都不存在高度保守的16S rDNA序列。因此, PCR法检测细菌16S rRNA基因具有特异性强的特点, 而且与传统的培养法比较最大的优势是检测结果不受标本中存在的各种抗菌药物的干扰, 可动态观察患者体内或病灶内是否存在病菌。Krieger等[5]曾采用PCR法检测慢性盆腔疼痛综合征患者的前列腺活检组织, 研究发现, 77%的患者细菌16s rRNA基因阳性。此外, 周立权等[6]报道在59例慢性盆腔疼痛综合征患者中有46例EPS细菌信号阳性, 其阳性率为78%, 并且对该46例患者使用抗生素治疗, 有效率达70.0%, 而对细菌信号阴性的13例患者均无效。本次研究结果显示102例慢性前列腺炎患者中71例细菌信号阳性, 其阳性率为69.61%, 与周立权等[6] 和Krieger等[5]报道的结果相近。在培养法阴性的84例标本中有56例PCR法得到阳性结果, 即检测出细菌16s rRNA基因序列, 比率为66.67%, 比赵岩等[7]报道的用PCR法对培养法阴性的病例中进行检测所得到的42.6%的阳性结果高, 其原因可能为赵岩等[7]所选择的标本既有EPS, 也有终末尿(VB3), 而本次实验标本仅有EPS, 而对于诊断慢性前列腺炎用EPS作为检测标本更具有代表性。另外, 本次实验中培养法阳性的 3例标本PCR法结果阴性, 这与有关文献[8]报道的PCR法检测EPS细菌16S rRNA基因的灵敏度为100%, 特异度为48%不符, 究其原因可能是前列腺液留取量较少, 在操作过程中导致DNA丢失所致。本次研究中还将细菌培养结果与PCR法所检测的结果进行χ 2检验, 显示两者间的差异具有统计学意义, 表明PCR法检测阳性率高于细菌培养法。将PCR法用于临床检测慢性前列腺炎不但可以提高诊断速度, 而且还可以提高诊断的准确性, 能更好地为临床医生提供诊断信息, 降低漏诊率。

根据刘士军等[9]的报道有相当一部分细菌所致的慢性细菌性前列腺炎由于多种因素归入了Ⅲ 型前列腺炎即慢性非细菌性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征, 但是其实验结果发现87例Ⅲ 型前列腺炎前列腺液16S rDNA PCR阳性71例, 阳性率达82%。另谢辉等[10]研究发现, 前列腺炎标本16S rRNA基因阳性率(48.9%)高于非前列腺炎标本(5.3%, P< 0.001), 而其前列腺组织病理检查呈慢性前列腺炎者百分率为32.9%。结合本次实验结果, 说明细菌感染仍然是引起慢性前列腺炎的重要原因。

综上所述, 我们认为PCR法检测前列腺液中细菌16S rRNA基因对慢性前列腺炎的临床诊断具有重要意义。PCR法与细菌培养法阳性率间的差异具有统计学意义, 进一步说明细菌培养法检测慢性前列腺炎具有一定局限性, 将PCR技术用于临床能有助于患者得到及时、有效地治疗。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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