LC-10AD vp 高效液相色谱仪, SPD-10AD vp紫外检测器(日本岛津公司), 岛津ODS(150 mm× 4.6 mm, 5 μ m); 衍生条件为4.6 mg/mL丹酰氯溶液, 2 mol/L KHCO₃-KOH缓冲体系, 80 ℃水浴下30 min。流动相为甲醇: 水=35: 65, 用12 mol/L硫酸调pH值至2.5, 三乙胺占水体积的1%, 四丁基氢氧化胺5 mol/L; 流速为1.5 mL/min; 波长286 nm; 等度洗脱。其余仪器、试剂及实验过程见文献[1]。

正常和注意缺陷多动障碍(ADHD)模型大鼠脑组织6种递质含量见表1, 方法学评价见文献[1]。

表1

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表1 正常和ADHD模型大鼠脑组织6种递质含量( x̅± s, nmoL/g脑组织湿重) 组别 Glu Asp Gly Tau Ala GABA 正常组 28.5± 4.6 14.2± 0.7 15.2± 4.8 26.9± 4.4 32.7± 3.3 84.5± 2.7 模型组 40.7± 5.3 19.2± 0.9 10.2± 3.9 22.7± 3.4 32.0± 3.8 60.3± 4.5

表1 正常和ADHD模型大鼠脑组织6种递质含量( x̅± s, nmoL/g脑组织湿重)

反应的温度、时间, 缓冲液的pH值及丹酰氯的浓度都是衍生反应的重要影响因素。不同的文献对衍生反应条件报道不一, 以反应温度为例, 从室温到90 ℃均有报道^[2~4]。用固定浓度氨基酸(25 μ g/mL)溶液, 在缓冲液、反应时间均一致的条件下分别在室温及水浴为40、70、80、95 ℃的条件下进行衍生反应, 衍生物注入色谱仪分析。结果显示衍生物的量随温度升高而升高。在95 ℃时衍生物的量约是40 ℃时的10倍。尽管高温能增加衍生物的量, 但是在较高温度(> 90 ℃)溶剂的挥发也相应增加, 以致反应混合物会喷出, 故选择80 ℃做为衍生反应温度。

最长报道的衍生反应时间是3 h ^[2~4]。在衍生温度为80 ℃时, 结果表明多数氨基酸(25 μ g/mL)最佳的反应时间是30 min, 但甘氨酸最佳衍生时间是60 min。本研究选择的反应时间是30 min, 然后加20 μ L冰醋酸终止反应。丹酰氯浓度是影响衍生反应完全程度的重要因素。取50 μ L大鼠脑组织上清, 各种氨基酸的浓度为50~100 μ g/mL, 加入20~200 μ L不等的丹酰氯溶液。结果显示在50 μ L内衍生产物随丹酰氯增加而增加, > 50 μ L衍生产物增加不显著, 当> 100 μ L时随丹酰氯增加而减少, 可能是衍生产物分解增加, 50 μ L的丹酰氯大约为4.6 mg/mL。

丹酰氯水解后产生一个较大的水解峰容易与氨基酸衍生物的峰重叠。当流动相的pH值为2.5时, 丹酰氯水解峰变狭窄, 同时在流动相中加入三乙胺、四丁基氢氧化胺改善分离, 在前述色谱条件下各目标峰基线分离, 见图1。pH值和离子对是色谱分离的关键。为考察其余的15氨基酸是否干扰待测的6种氨基酸, 分别进行衍生分析。结果表明精氨酸(Arg)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、谷氨酰胺(Gln)、酪氨酸(Tyr)和羟脯氨酸(Hyp)能和待测的6种氨基酸分离, 见图1。而半胱氨酸(Cys)、蛋氨酸(Met)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(He)、赖氨酸(Lys)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、组氨酸(His)和蛋白质在所建立的色谱条件下不能洗脱, 因此在每次样本测定完毕需要用100%甲醇冲洗色谱柱。

图1

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	图1 各物质色谱图

尽管丹酰氯衍生氨基酸产物能用紫外和荧光检测器检测, 但在该色谱条件下使用紫外检测器比荧光检测器更灵敏, 最大吸收波长约在286 nm, 分离这12种衍生物需要35 min。在该色谱条件下, 克服其他氨基酸的干扰, 使方法准确性、重现性更好, 适用于脑组织中氨基酸类神经递质的含量测定。