引用本文
田桢干, 沈小明, 方筠, 张晓航, 章琪, 赵冰. 实时荧光定量聚合酶链反应检测沙门菌(A~F群)方法的建立和应用. 2009, 24(2): 134-136
  
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实时荧光定量聚合酶链反应检测沙门菌(A~F群)方法的建立和应用
田桢干1, 沈小明2, 方筠1, 张晓航1, 章琪1, 赵冰3
1. 上海出入境检验检疫局国际旅行卫生保健中心,上海 200335
2. 上海市疾病预防控制中心,上海 200336
3. 上海市浦东新区疾病预防控制中心,上海 200125

作者简介:田桢干,男,1972年生,硕士,副主任医师,主要从事出入境人员检验检疫工作。

摘要
目的

建立实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测沙门菌,评价其优越性。

方法

根据沙门菌保守的HilA基因序列合成引物和探针,建立快速检测沙门菌的实时荧光定量PCR。

结果

所建立的实时荧光定量PCR具有简便、快速、敏感性高、特异性强、抗干扰性好和可重复性强等特点,与实际应用检测结果相符。

结论

建立的实时荧光定量PCR可用于口岸食品和公共场所从业人员的沙门菌检测。

关键词: 沙门菌; 实时荧光定量聚合酶链反应; 检测
中图分类号:R446.5 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2009)02-0134-03
Abstract
Keyword:

长期以来, 传统沙门菌检测的阳性检出周期为4~7 d, 费力费时, 且操作比较繁琐, 漏检率高, 难以适应快速抽检和调研的要求。聚合酶链反应(PCR)因其简便、快速、敏感性高和特异性强的优点, 已广泛用于遗传病诊断、微生物检测及分子生物学研究等诸多领域[1]。尤其新近发展的荧光定量PCR在保证了其特异性、敏感性的前提下, 可以达到自动化[2], 从而保障了检测的规范性。本研究旨在利用TapMan探针法建立实时荧光定量PCR检测沙门菌的方法, 使之能应用于日常检测工作中。

材料和方法
一、实验材料

标准菌株为鼠伤寒沙门菌(ATCC 50013)。样本菌株来自各类肛拭样本。营养肉汤亚硒酸盐(SF)增菌液(上海市疾病预防控制中心中国腹泻病控制上海试剂供应研究中心); CHROMagar沙门菌显色培养基(郑州安图绿科生物工程有限公司); 沙门菌属56种诊断血清(卫生部成都生物制品研究所); VITEK快速革兰阴性鉴定卡和API20E肠道菌鉴定条(法国生物梅里埃中国有限公司); 乳糖发酵管等生化试剂(上海市疾病预防控制中心中国腹泻病控制上海试剂供应研究中心)。仪器:VITEK细菌鉴定仪和美国ABI公司PE770荧光定量PCR仪。

二、常规法分离

按国际标准GBPT 4789.4-2003对样本进行沙门菌检测, 在分离培养的同时将增菌液划线于科玛嘉沙门菌显色板, 挑可疑菌落(紫色或紫红色)进一步试验, 所有分离菌株最后经传统国标法结合API生化鉴定为金标准进行鉴定。

三、引物和探针的设计与合成

引物和探针的合成参照沙门菌NCBIgene:AY712754中保守的Salmonella typhimurium HilA(hilA)基因序列[3], 采用美国ABI Primer express 2.0实时荧光定量PCR引物设计软件设计, 探针的光标记选择荧光基团6-羟基-荧光素(FAM)作为报告发光基团, 以羧基四甲基若丹明T(AMRA)为淬灭基团, 引物由上海赛百盛基因公司合成, 探针由上海中科开瑞生物技术公司合成。上游引物:5'-ACTCTATCGTGAAGGGATTATCGC-3'; 下游引物:5'-TAACACTGCGGCAGTTCTTCG-3'; 探针设计:5'-FAM-AATGGTCACCGGCAGCACGCTCAG-TAMRA-3'。

四、DNA模板的制备

1. 增菌 按国家标准检测方法GB/T4789.4-2003中规定的步骤, 采用选择性亚硒酸盐菌液进行培养。

2. DNA提取 取增菌液1.0 mL于1.5 mL离心管中, 12 000 r/min离心10 min, 弃上清, 沉淀中加入100 μ L裂解液, 搅匀后于100 ℃金属浴10 min, 最后10 000 r/min离心1 min, 上清待测。同理将已知的阳性实样对照按上述步骤操作。

五、实时荧光定量PCR反应体系的建立

1 μ L Tap酶+20 μ L反应液+3 μ L模板; PCR扩增条件设置:37 ℃ 2 min, 94 ℃ 5 min, 然后94 ℃ 10 s、60 ℃ 40 s循环40次; 数据采集点设置在60 ℃ 40 s, 荧光设置为FAM检测。同时做试剂空白对照、试剂盒阳性对照以及实样阳性对照。

六、实时荧光定量PCR方法评价

将国家标准菌株鼠伤寒沙门菌(ATCC 50013)接种于营养琼脂斜面, 培养24 h后, 洗下菌苔以麦氏比浊法调至菌液浓度约108 cfu/mL, 以生理盐水10倍梯度稀释。从各稀释度中分别取100 μ L稀释液按标准法涂于选择性琼脂平板培养后计数和, 再取100 μ L稀释液按荧光定量PCR作敏感性检测, 并进行特异性、抗干扰性和可重复性等方法学评价。

七、应用性评价

应用所建立的实时荧光定量PCR对口岸食品和公共场所从业人员进行沙门菌检测。

结 果
一、敏感性检测

将浓度约108 cfu/mL的标准菌株液, 按106、105、104、103、102、101、100对鼠伤寒沙门菌进行梯度稀释, 用本研究建立的荧光定量PCR进行检测, 按域值循环(Ct)值≤ 35时结果判定为阳性, 本法的检测敏感性可达102 cfu/ mL, 见表1。

表1 敏感性检测试验结果
二、特异性检测

用建立的沙门菌荧光定量PCR检测沙门菌菌株, 包括甲型副伤寒(A群)、鼠伤寒(B群)、猪霍乱(C1群)、纽波特(C2群)、伤寒(D群)、肠炎(D群)、伦敦(E1群)、山夫登堡(E4群)和阿伯丁(F群)等, 同时检测弗氏枸橼酸杆菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、蜂房哈夫尼菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、坂崎肠杆菌、痢疾志贺菌、福氏志贺菌、鲍氏志贺菌、宋内志贺菌、铜绿假单胞菌等非沙门菌株, 结果对所有沙门菌株均检出阳性, 而非沙门菌均为阴性。

三、抗干扰性检测

沙门菌和大肠埃希菌不同比例混合, 用于显色平板和PCR的检测比较试验。采用平板计数法, 确定沙门菌细菌数量为106/mL, 将沙门菌和大肠埃希菌按10: 1、1: 1、1: 10、1: 100、1: 1 000、1: 10 000混合, 分别取混合物1 mL用PCR和显色平板方法进行检测。沙门菌与大肠埃希菌组成比例为1: 10 000时, 用显色平板方法检测为阴性, 而PCR则能检出。

四、重复性检测

对106 cfu/mL鼠伤寒、阿贡纳、罗米他重复3次检测, 结果见表2。

表2 可重复性检测试验结果
五、实际应用检测结果评价

应用所建立的实时荧光定量PCR对口岸食品和公共场所从业人员进行沙门菌检测, 结果2006年3月至2006年9月上海口岸饮食和公共场所的从业人群体检共计4 856人次, 作细菌分离, 以API生化鉴定和血清凝集为金标准比较, 4 856份样本血清凝集实验阳性29份, 而荧光定量PCR实验30份, 结果见表3。2种检测沙门菌方法的结果具有关联性, 二者存在正关联(φ =0.983); 2种方法的一致性为优(Kappa值=0.983), 荧光定量PCR实验诊断与金标准检测结果之间的差异无统计学意义(P=1.00)。

表3 荧光定量PCR实验诊断与细菌分离鉴定结果比较
讨 论

在食品安全卫生领域, 从定性和定量检测技术两方面出发, 准确、可靠、方便、快速、经济、安全的检测方法是食品安全检测的发展方向, 尽可能使快速检测技术的敏感性及准确度达到标准限量的必须要求, 至少要与标准方法检测结果相当, 能在较短的时间内检测大量的样本, 还具有实际应用价值, 这是当前迫切需要的。荧光定量PCR运用分子生物学的方法从沙门菌特定基因序列中选取引物, 标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合反应后, 借助于荧光信号来检测PCR产物, 一方面提高了敏感性, 另一方面还可以做到PCR准确地确定Ct值, 确定起始DNA拷贝数, 达到DNA定量, 能够满足当前食品安全卫生领域微生物检测方面的要求, 该方法在口岸卫生检疫工作中有广阔的应用前景。

如何提高沙门菌检出率、缩短检测时间、简化检测程序, 建立敏感性高、特异性强、重复性好、简易经济的技术一直是沙门菌检验研究的核心问题和发展方向[4]。本研究所选用的引物和探针在敏感性、特异性、抗干扰性和可重复性等方面取得了较为满意的结果, 如在敏感性(100%)、特异性(99.97%)、符合率(99.98%)、约登指数(0.999 7)等方面比传统方法好, 且克服了传统微生物检验方法的局限性, 如检测周期长、步骤繁琐、许多因素难以控制等。利用该方法对上海口岸从业人群进行沙门菌检测, 在2006年3至9月间体检4 856人次, 鉴定出沙门菌阳性29例, 总的阳性检出率为0.597%, 高于上海市疾病预防控制中心规定的0.15%[5], 说明利用新方法后阳性检出率显著提高。

运用荧光定量PCR检测沙门菌, 将大幅度提高检测效率, 既可减少工作量, 又可缩短阴性检测时间。该方法的应用解决了传统检测方法在大批量健康人体检中可能存在的沙门菌阳性漏检问题, 最大限度地防止口岸从业人员因带菌而引起的食源性疾病的发生, 维护了出入境人员的健康。本研究存在不足之处, 出现了1例假阳性, 在排除样本污染的情况下, 最可能的原因是细菌未生长。对于筛检实验来说, 在保证阳性检出可靠性的前提下, 特异性越强越好, 这是实验需要进一步提高完善的地方。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] Tondella MLC, Talkington DF, Honlloway B P, et al. Development and evaluation of real-time PCR-based fluorescence assyays for detection of Chlamydia pneumonniae[J]. J Clin Microbiol, 2002, 40(2): 575-583. [本文引用:1]
[2] 黄留玉. PCR最新技术原理、方法及应用[M]. 北京: 化学工业出版社, 2004: 131-159. [本文引用:1]
[3] Guo X, Chen J, Beuchat LR, et al . PCR detection of Salmonella enterica serotype montevideo in and on raw tomatoes using primes derived from hilA[J]. Appl Environ Microbiol, 2000, 66(12): 5248-5252. [本文引用:1]
[4] 宋志军, 宋长绪, 杨增歧, 等. 猪繁殖与呼吸综合征病毒TapMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J]. 中国兽医科学, 2006, 36(2): 98-102. [本文引用:1]
[5] 娄峥. 嘉定区职业人群沙门菌携带状况分析[J]. 疾病监测, 1996, 11(10): 371-373. [本文引用:1]