1992年开始, NCCLS制定了试管稀释法及其指导性文件。但由于该试验费时, 耗资多, 几经修订, 目前已被M27-A2和M38-A等微量液体稀释法所取代。方案对接种菌制备、接种量大小、培养基、孵育温度和时间以及终点判定等因素都进行了具体规定, 规范性强, 重复性和一致性好。M27-A2和M38-A中受试的抗真菌药物在原有两性霉素B、氟胞嘧啶、伊曲康唑、氟康唑基础上增加了伏立康唑、泊沙康唑、雷夫康唑的试验方法。关于棘白菌素类(卡泊芬净、阿尼芬净、米卡芬净)体外敏感试验目前尚未标准化, 由于此类药存在拖尾现象, 特别是对曲霉菌属, 其最低抑菌浓度(MIC)有很大差异, 对此有学者建立了最低有效浓度(MEC)检测方法, 但还未得到NCCLS的认可^{[1, 2]}。

酵母菌生长部分受抑制出现的拖尾现象, 使得氟胞嘧啶和唑类药物(尤其是氟康唑)48 h判读受到影响, 出现低-高MIC现象, 即24 h无拖尾现象而48 h出现。M27-A2方案建议如果孵育24 h对照菌生长情况理想, 读取24 h MIC结果, 并提供了24 h质量控制的标准, 这或许更便于及时指导临床用药。此外, M27-A2提出在临床实践中, 发现Antibiotic Medium 3(含2%葡萄糖)(AM3, BBL, Cockeysville, Md)可能对两性霉素B耐药株的检出更为可靠, 并建议用pH值7.0酵母氮肉汤(YNB)菌液终浓度为1× 10⁴ cfu/mL培养新生隐球菌^[1]。

M38-A是在M27-A2基础上对产孢丝状真菌的试验方案进行规范。在终点判读上由于伊曲康唑和新型三唑类药物不产生拖尾现象, M38-A将其MIC值定义为100%生长抑制, 即读数为0时的最低药物浓度。目前, M38-A仅限于曲霉属、镰刀菌属、根霉、波氏霉等的菌丝相, 不包括双相真菌的酵母相^[2]。不少学者应用此方案所描述的试验程序, 从接种量、孵育温度、孵育时间以及终点判读等方面, 探讨了常见皮肤癣菌如红色毛癣菌和暗色真菌的抗真菌药敏试验, 同时评价特比萘芬和其他一些新型药物的抗真菌活性, 结果理想, 有望拓宽该方案的应用范围, 建立有关红色毛癣菌和暗色真菌的抗真菌药敏试验标准化方案^[3]。

大量的药代动力学、药效学以及临床研究工作, 使药敏试验的折点逐渐接近临床的实际情况, 在唑类药物治疗念珠菌病方面尤为成熟。2002年NCCLS M27-A2公布了氟康唑、氟胞嘧啶、伊曲康唑3种抗真菌药物的判定折点, 2006年M27-S2又补充了第3代唑类药物伏立康唑的判定折点^[4], 见表1。目前无丝状真菌药敏试验的解释折点。

表1

表1

表1 唑类药物MIC折点 抗真菌药物 MIC(μ g/mL) S SDD I R 氟康唑 ≤ 8 16 ~32 - ≥ 64 伊曲康唑 ≤ 0.125 0.25 ~0.5 - ≥ 1 伏立康唑 ≤ 1 2 - ≥ 4 氟胞嘧啶 ≤ 4 - 8 ~16 ≥ 32 注:S 敏感; SDD 剂量依赖敏感; I 中介; R 耐药

表1 唑类药物MIC折点

纸片扩散法是一种琼脂扩散法, 即将受试菌均匀地涂布至琼脂培养基上, 将浸透药物的纸片放置其上, 经孵育后, 根据纸片周围真菌生长被抑制的范围大小来确定该抗真菌药物对此菌的抑制效力。该方法较之美国临床实验室标准化研究所(CLSI)肉汤稀释法操作更为简单、廉价, 孵育的时间随之缩短(一般为24 h), 更利于在实验室中开展, 已成为了众多学者研究的热点。

2003年CLSI起草了《酵母菌的纸片扩散法抗真菌药物敏感试验参考方案》(M44-P), 并于2004年修订出版M44-A, 对实验方法、氟康唑判定标准以及质控株对氟康唑、伏立康唑的数值范围进行了说明, 2006年M44-S1又增添了伏立康唑的判定标准, 见表2^[5]。此外, 现代高科技的电子镜像分析系统的运用, 可以在短期内对大批待测菌株进行高精确度的分析, 快速得出试验结果, 这对于在全球研究菌株耐药性变异、新的抗真菌制剂的药物活性等都有极大的帮助, 有很大的应用前景。2006年CLSI年度会议上又提出了泊沙康唑、卡泊芬净的质控株数值范围^[6]。近几年, 国外不少学者还将该方案应用于检测丝状真菌的药敏活性, 多中心对555株丝状真菌作伏立康唑、泊沙康唑、伊曲康唑、两性霉素B和卡泊芬净药敏试验。通过与M38-A肉汤稀释法比较, 提出了丝状真菌抗真菌药敏试验的优化条件:(1)与酵母菌生长情况不同, 美兰葡萄糖琼脂平板(MGM)不利于丝状真菌的生长, 水解酪蛋白胨(MH)琼脂上抑菌圈反而更为清晰, 应被使用; (2)孵育时间, 接合菌属(16~24 h)、曲霉菌属[烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉(24 h)、其他(48 h)], 在MH和对应的孵育时间, 重复性可达91%~100%(除接合菌, MGM更佳); (3)假定泊沙康唑(5 μ g)、伏立康唑(1 μ g)、伊曲康唑(10 μ g)、卡泊芬净(5 μ g)MIC/MEC和M44-A判读标准为(敏感≤ 1 μ g/mL, ≥ 17 mm; 中介2 μ g/mL, 14~16 mm; 耐药≥ 4 μ g/mL, ≤ 13 mm); 两性霉素B(10 μ g)MIC/MEC和M44-A判读标准为(敏感≤ 1 μ g/mL, ≥ 15 mm; 中介2 μ g/mL, 13~14 mm; 耐药≥ 4 μ g/mL, ≤ 12 mm), 与M38-A肉汤稀释法比较, 泊沙康唑、伏立康唑、卡泊芬净符合率较高, 为81%~96%(但不适用于天然耐药接合菌、出芽足放线菌、镰刀菌属); 两性霉素B和伊曲康唑符合率为65%~88%, 其中两性霉素B对曲霉属符合率低, 而对接合菌符合率最好; 伊曲康唑不适用于接合菌^[7]。

表2

表2

表2 M44-A纸片扩散法抑菌圈直径 抗真菌药物 抑菌圈直径(mm) S SDD R 氟康唑(25 μ g) ≥ 19 15~18 ≤ 14 伏立康唑(1 μ g) ≥ 17 14~16 ≤ 13

表2 M44-A纸片扩散法抑菌圈直径

Rosco真菌药敏纸片由丹麦Rosco公司所研发, 提供多达16种抗真菌药敏纸片, 结果清晰易读取, 为欧洲各国广泛使用。因其适用药物范围大, 操作简便, 国内实验室应用比例也很高。随着M44-A标准方案颁布, Rosco公司也做了相应的改进, 如氟康唑药物浓度从15 μ g改为25 μ g, 推出伏立康唑(1 μ g)药物, 并制定新的判读标准(包括2种培养基MGM和Shadomy及其判读标准)。目前就新的判读标准与CLSI肉汤稀释法的符合率研究开展较少。Espinel-Ingroff等^[8]评价Rosco抗真菌药物(氟康唑25 μ g、伏立康唑1 μ g、伊曲康唑8 μ g、卡泊芬净5 μ g、两性霉素B 10 μ g)在3种培养基上(MGM、RPMI1640含2%葡萄糖、Shadomy)对酵母菌(假丝酵母菌属和新生隐球菌)的影响。质控株于MGM培养基上抑菌圈大小落在M44-A范围内, 另2种培养基则变化较大。沿用M44-A判定标准, 在MGM培养基上与M27-A2符合率达92.7%~98.2%, 明显好于另2种培养基。Rosco因两性霉素B耐药株检测能力有限, 不适用于临床。

E-test是琼脂扩散法的改良, 原单一药物浓度纸片用含有梯度浓度排列的药液条代替, 通过两者形成的椭圆形抑菌圈, 可判断药物的MIC值。Yeastone法是在一次性干性96孔微孔板分别装有5种系列稀释浓度的被染色的抗真菌制剂和氧化还原指示剂(alamar blue), 通过视觉颜色明显变化来判读MIC值。美国病理学和微生物学会于2001~2003年对近3 000个微生物药敏实验室做的抽样结果显示, 抗真菌药敏试验中应用最多的是Yeastone法, 用于复杂菌群药物敏感试验最多的方法却是E-test^[9]。

早前E-test和Yeastone法应用于酵母菌研究, 具有较好的重复性和精确度。最近多中心试验研究表明, 可用于新型抗真菌制剂泊沙康唑、雷夫康唑、伏立康唑、卡泊芬净等的敏感试验, 且还可以用于丝状真菌的药敏试验。如Alexander等^[10]用E-test、Yeastone法测定氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑、氟胞嘧啶、卡泊芬净、两性霉素B对212株临床分离假丝酵母菌MIC值和M27-A2肉汤稀释法的一致率, 总一致率(即MIC值不> 3个稀释度):E-test各种抗真菌药物均> 92%, Yeastone法大体> 92%(除了氟康唑82%, 伏立康唑85%); E-test和Yeastone法较M27-A2显示更高的MIC值(除了卡泊芬净); 聚类一致率:24 h E-test为90%、Yeastone法为88%, 其中光滑假丝酵母菌(氟康唑、伊曲康唑)和热带假丝酵母菌(伊曲康唑)对于唑类药物符合率最低。Guinea等^{[11, 12]}应用Yeastone法、E-test和M38-A进行临床株烟曲霉对两性霉素B、伊曲康唑、伏立康唑的体外敏感试验, 结果发现48 h读取结果最佳, 符合率均> 90%。Espinel-Ingroff^[13]用E-test、Yeastone法测定126株临床曲霉菌和92株接合菌对泊沙康唑、两性霉素B MIC值和M38-A的一致率, 结果显示:(1)泊沙康唑, Yeastone法对接合菌16~24 h符合率为98%~100%, 对曲霉菌24~48 h符合率为99%; E-test方法符合率为94%~97%; (2)两性霉素B, 2种方法符合率为95.0%~99.3%。

多项研究指出E-test和Yeastone法检测光滑假丝酵母菌和热带假丝酵母菌对唑类药物MIC值与M27-A2符合率偏低, 认为该菌种对唑类药物的MIC值仍需进一步研究评估^{[10, 14]}。此外孵育时间对于MIC值影响较大, 尤其是不同假丝酵母菌菌种对唑类药物, 24 h结果符合率是否优于48 h还有疑问。Sims等^[14]评价E-test和M27-A2检测泊沙康唑的符合率, 发现光滑假丝酵母菌24 h(72%)要优于48 h(56%), 而热带假丝酵母菌48 h(71%)优于24 h(39%)。另一E-test和M27-A2对氟康唑的符合率研究则显示, 热带假丝酵母菌和白假丝酵母菌24 h要优于48 h。Espinel-Ingroff等^[15]评价Yeastone法和M27-A2检测泊沙康唑、雷夫康唑、伏立康唑的符合率, 发现24 h(95%~99%)要优于48 h(80%~97%), 尤其是白假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌、热带假丝酵母菌。另一Yeastone法和M27-A2对伏立康唑的符合率研究则发现, 即使24 h, 符合率< 90%^[16]。

虽然E-test重复性好, 敏感性高, 可为临床工作提供可靠的信息, 但由于其价格昂贵, 在国内实验室中应用较少。一般是用于肉汤稀释法耐药株检出能力弱的情况, 如两性霉素B, 或是被用于判断致病真菌对新型抗真菌制剂的敏感性。

虽然大量研究证实纸片扩散法、E-test、Yeastone法和标准的CLSI肉汤稀释法的MIC具有较高的符合率, 是代替液基药敏法的理想选择, 但这些方法存在需24~48 h、甚至48~72 h才能判断生长终点的缺陷。近几年科学家们努力寻找新型抗真菌药敏方法, 使早期判断药敏结果成为可能, 如流式细胞术(只需6 h)、葡萄糖消耗法(RSA, 只需8 h)。这些方法另一优点是可克服判读结果的主观性错误(尤其是唑类药物的拖尾现象), 结果更为客观可信。

流式细胞术的原理是用适当的荧光染料对受损的真菌进行染色后通过流式细胞仪检测生存力, 以此得到MIC值。应用最广的是FUN-1探针, 一种透膜荧光探针, 在有代谢活性的细胞内可变成桔红色小管状物质(CIVS), 而在受损细胞内不变色。利用FUN-1染色的途径在不同实验室有所不同。有暴露给药物后菌丝活力发生的改变, 或是通过分生孢子活力来判断真菌生长情况^[9]。RSA则是利用真菌被抗真菌药物抑制时, 其摄取营养成分葡萄糖的能力下降, 培养基中剩余的葡萄糖浓度高的原理设置测试孔和对照孔, 通过比较各药物浓度孔的葡萄糖含量, 求得MIC值^[17]。

虽然对于这些新型抗真菌药敏试验应用于临床的研究还处于起步阶段, 但已有资料显示他们有着一定的应用前景。如Peter等^[18]应用膜通透性探针DiOC6和细胞质酯酶探针CFDA检测假丝酵母菌属和曲霉菌属对两性霉素B和卡泊芬净的MIC值, 与CLSI肉汤稀释法符合率分别为83%~100%、79%~100%。Li等^[17]应用RSA检测106株临床假丝酵母菌对两性霉素B、氟胞嘧啶、氟康唑、伊曲康唑的MIC值, 与M27-A2符合率两性霉素B和氟胞嘧啶分别为100%和98%, 而氟康唑和伊曲康唑为61%~63%。Chen等^[19]将RPMI1640培养基改为含0.12 g葡萄糖的YNB, 结果改良的RSA氟康唑和伊曲康唑MIC值与M27-A2符合率提高为72.9%~88.1%和82.2%~89.8%。

CLSI所颁布的体外抗真菌药物敏感试验标准方法, 使得人类在选用抗真菌药物以及研究新的抗真菌制剂方面有了有章可依的标准化道路。这几年, 标准方法不断更新、完善, 包括方案中新的抗真菌药物的加入、原有培养基或终点判断的改变、新折点的设立, 将该标准方案拓展至更广的真菌群, 使得标准方案更为合理、面更广地为临床医师提供科学的用药指示, 为新一代涌现的抗真菌制剂提供可靠的评价方法。此外, CLSI颁布M44-A标准纸片扩散法以及不少公司和实验室提出的新方法和技术, 使得抗真菌药敏试验方法更为方便、廉价、快速, 更易于临床实验室开展。有些新型抗真菌药敏试验与CLSI标准方案有较高的一致性, 可作为CLSI肉汤稀释法的代替方案。但也存在一定的缺陷, 如纸片扩散法不能较好地区分敏感株和剂量依赖敏感株, 而所检测的耐药株仍需用CLSI标准方案加以证实。因此, 不管是标准方案还是新型抗真菌药敏试验, 还需不断地收集完整和详细的临床试验资料, 特别是耐药株的临床疗效, 深入了解体内-体外的一致性。相信不久的将来, 新的抗真菌药物折点会建立(尤其是丝状真菌), 新型的药敏试验方法能更客观地反应临床疗效, 为临床提供更快、更为合理的诠释和判断, 更好地发挥临床实验室在侵袭性真菌感染治疗中的重要作用。