引用本文
朱岚, 黄飚, 张珏, 陈永伟, 李跃松, 周彬. 甲状腺过氧化物酶抗体间接时间分辨荧光免疫分析法的建立及临床应用. 2009, 24(12): 895-898
ZHU Lan, HUANG Biao, ZHANG Jue, CHEN Yongwei, LI Yuesong, ZHOU Bin. Establishment of an indirect time-resolved fluoroimmunoassay for thyroid peroxidase antibody and its clinical application. Labratory Medicine, 2009, 24(12): 895-898  
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甲状腺过氧化物酶抗体间接时间分辨荧光免疫分析法的建立及临床应用
朱岚, 黄飚, 张珏, 陈永伟, 李跃松, 周彬
江苏省原子医学研究所,江苏 无锡 214063

作者简介:朱 岚,女,1979年生,学士,助理研究员,主要从事临床免疫分析研究。

摘要
目的

建立甲状腺过氧化物酶 (TPO) 抗体间接时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)。

方法

用TPO抗原包板,用铕(Eu3+)标记兔抗人IgG做标记物,建立检测人血清TPO抗体的间接TRFIA。

结果

TPO抗体-TRFIA的敏感性为1.0 IU/mL;线性范围达1 000 IU/mL;批内变异系数( CV)为3.1%~3.6% ,批间 CV为3.3%~3.6% ;平均回收率为98.89%;与电化学发光分析法(ECLIA)比对,相关系数达0.983 2;与临床诊断高度相关。

结论

本研究建立的TPO抗体-TRFIA是一个高灵敏和可靠的检测方法,有助于甲状腺疾病的临床诊断。

关键词: 甲状腺过氧化物酶抗体; 时间分辨荧光免疫分析法; 甲状腺疾病
中图分类号:R446.61 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2009)12-0895-04
Establishment of an indirect time-resolved fluoroimmunoassay for thyroid peroxidase antibody and its clinical application
ZHU Lan, HUANG Biao, ZHANG Jue, CHEN Yongwei, LI Yuesong, ZHOU Bin
Jiangsu Institute of Nuclear Medicine, Jiangsu Wuxi 214063, China
Abstract
Objective

To explore an indirect time-resolved fluoroimmunoassay(TRFIA)for the detection of thyroid peroxidase(TPO)antibody and its clinical application.

Methods

The TPO antigen was coated on the 96 well plates. Rabbit anti-human IgG-europium (Eu3+) was used as conjugate. Serum TPO antibody level was determined by the indirect TRFIA.

Results

The assay sensitivity was 1.0 IU/mL. The linear range was 1 000 IU/mL. Intrassay coefficient of variation ( CV) was 3.1%-3.6%. Interassay CV was 3.3%-3.6%. The average recovery was 98.89%. Correlation coefficient between TPO antibody-TRFIA and electrochemiluminescence immunoassay (ECLIA) was 0.983 2. The results were highly relevant to clinical diagnosis.

Conclusions

The indirect TRFIA for TPO antibody detection in serum is a sensitive and reliable assay which is useful to clinical diagnose for thyroid diseases.

Keyword: Thyroid peroxidase antibody; Time-resolved fluoroimmunoassay; Thyroid disease

甲状腺过氧化物酶 (thyroid peroxidase, TPO) 抗体普遍存在于自身免疫性甲状腺疾病(autoimmune thyroid disease, AITD)中, 测定其值对了解人体甲状腺功能具有重要意义, 是毒性弥漫性甲状腺肿(Graves' 病)、桥本氏甲状腺功能亢进症诊断、鉴别诊断及疗效观察的首选指标 [1, 2]。经过探索和研究, 我们建立了TPO抗体间接时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)。

材料和方法
一、材料

1.研究对象 153例甲状腺疾病患者和32例非甲状腺疾病患者为江苏省江原医院住院和门诊患者; 252名甲状腺功能正常者为健康体检者。

2.试剂和仪器 兔抗人IgG(华美生物工程公司); TPO抗原(Medix公司); 防腐剂(Proclin-300, Supelco公司)、聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯(Tween 20, Sigma公司); 牛血清白蛋白(BSA, 深圳晶美生物工程有限公司); 铕(Eu3+)标记盒(PE公司); 凝胶过滤(Sepharose CL-6B)柱(Pharmacia公司)。TPO抗体国家标准品(150557-200601, 中国药品生物制品检定所)。96孔微孔板(Nunc公司)。洗脱液、增强液、洗涤液、质控均为本室自配, 其他试剂均为国产分析纯。冻干机(上海东富龙冷冻干燥设备公司)。DELFIA 1235全自动TRFIA检测仪(PE公司), Elecsys电化学发光仪(2010型, 线性范围为5~600 IU/mL)及TPO抗体检测试剂(Roche公司)。

二、方法

1.TPO抗体标准品的配制 收集临床检测TPO抗体高值血清(乙型肝炎病毒抗原、丙型肝炎病毒抗体、人类免疫缺陷病毒抗体均为阴性), 合并, 加Proclin -300适量。经反复冻融、离心、过滤等处理后得到标准品原液, 用人去激素血清(含0.1%叠氮钠)配制成不同浓度的标准品, 用TPO抗体国家标准品校准各标准点的浓度, 每瓶1 mL分装, 冻干, -20 ℃保存。

2.固相抗原包被板的制备 TPO抗原采用50 mmol/L Na2CO3-NaHCO3缓冲液(pH值9.6)稀释至合适浓度, 每孔200 μ L包被, 振荡30 min, 4 ℃过夜。弃包被液, 每孔加250 μ L含有10% BSA的上述缓冲液封闭2 h, 真空抽干, 密封, 置-20 ℃保存。

3.Eu3+-兔抗人IgG的制备 1 mg的兔抗人IgG加入含有1 mg的Eu3+-N2-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu3+-DTTA)冻干粉的小瓶中, 25 ℃磁力搅拌反应20 h。反应液经用80 mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液(pH值7.8)平衡的Sepharose CL-6B柱(1 cm× 40 cm)层析, 控制流速为2 mL/min, 每管收集2 mL, 吸光度(280 nm)监测收集第一蛋白峰。

4.分析缓冲液的选择 制备4种不同的分析缓冲液:(1)0.05 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS), pH值 7.0, 0.5% BSA, 0.01% NaN3, 0.1% Tween-20; (2)0.05 mol/L Tris-HCl, 余同(1); (3)pH值7.8, 余同(2); (4)pH值 7.8, 1% BSA, 余同(2)。用这4种不同的分析缓冲液分别进行TPO抗体-TRFIA, 测定每种情况下的信噪比[TPO抗体浓度为5 IU/mL的相应反应孔荧光计数(CPS)与零标准的CPS的比值]。

5. TPO抗体-间接TRFIA 在包被TPO抗原的微孔反应板中加入用分析缓冲液稀释的样本200 μ L, 25 ℃振荡1 h, 洗涤4次, 再加入200 μ L用分析缓冲液稀释的Eu3+-兔抗人IgG, 25 ℃振荡0.5 h, 洗涤4次, 再加入增强液200 μ L, 25 ℃振荡反应5 min后检测。该过程由DELFIA 1235全自动TRFIA检测仪自动完成。TPO抗体-TRFIA标准曲线分析[有效剂量(ED)、变异系数(CV)等]及结果由DELFIA 1235全自动TRFIA检测仪随机配备的Multicalc软件自动给出。

三、统计学方法

应用SPSS 12.0统计软件进行分析。

结 果
一、实验条件的优化

1.固相TPO抗原包被浓度 TPO抗原包被浓度分别为0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μ g/mL, 进行TPO抗体-TRFIA检测。结果显示, 从0.125~2.0 μ g/mL包被板检测最大特异结合率(Bmax)上升很大, 而从2.0~8.0 μ g/mL包被板检测Bmax没有明显升高。所以选择TPO抗原2.0 μ g/mL浓度包板, 已经达到良好的免疫反应的效果。

2.分析缓冲液的影响 结果显示(1)~(4)分析缓冲液的信噪比分别为2.99、3.33、3.47、3.94。PBS分析缓冲液的信噪比低于Tris-HCl分析缓冲液; 在Tris-HCl分析缓冲液中增大BSA的浓度或提高pH值, 均能提高信噪比。故本研究选择(4)作为分析缓冲液。

3.反应时间选择 采用两步法, 定第2步反应时间为30 min, 使第1步反应体系在25 ℃分别反应0.5、1、1.5、2 h, 结果见图1(a)。第1步反应时间为0.5 h时, 未完全反应; 1 h时, 标准曲线呈线性, 达到要求; 1.5和2 h时, 计数虽依次提高, 但高浓度点出现钩状效应(hook effect), 由此选定第1步反应时间为1 h。在第1步反应时间为1 h的条件下, 使第2步反应体系在25 ℃分别反应20、30、40、60 min, 结果见图1(b), 同理可推出第2步反应时间为30 min。因此以(1+0.5)h为本试剂盒的免疫反应时间。

图1 反应动力学曲线图

二、方法学鉴定

1.TPO抗体-TRFIA标准曲线 采用Log/Log_B 数学拟合模式。标准品含量对数值为横坐标, CPS的对数值为纵坐标, 绘制剂量-反应曲线, 见图2。方法学线性范围达1 000 IU/mL。以国家标准品为标准对照, 定标品实际浓度与标示浓度回归方程为Y= 1.013 2X-0.531 2, r=0.999 9(P< 0.05)。

图2 TPO抗体-TRFIA 剂量-反应曲线图

2.敏感性 重复测定零剂量点20次, 以 x̅+2s的荧光值在曲线上得到相应浓度为检测低限, 则本方法的检测低限为1.0 IU/mL。

3.线性试验 将TPO抗体浓度为201.36、573.41和1 279.03 IU/mL的3份血清进行倍比稀释, 经测定稀释倍数与样本含量呈线性关系, r分别为0.999 6、0.999 8和0.999 5(P< 0.05); 相关方程分别为Y=197.5X+5.408, Y=572.3X+3.979, Y=1 279.1X+12.889, 表明本方法具有良好的健全性。

4.精密度 取本实验室自配的低、中、高浓度TPO抗体质控冻干品各20份, 批内、批间(20例)实验数据见表1。

表1 批内、批间变异实验结果

5.基质效应 取含量为38.72 IU/mL TPO抗体血清分别加到50、100和1 000 IU/mL标准参考品中进行回收试验。回收率为98.85%、99.26%和98.55%, 平均回收率为98.89%。

6.稳定试验 将该试剂盒置于37 ℃ 7 d后与4 ℃保存的整套试剂盒双孔平行对比检测标准参考品, 结果相关性良好(Y=0.660 3X+7 263.2, r=0.996 7, P< 0.05)。

三、临床考核

1.比对试验 用TPO抗体-TRFIA与电化学发光分析法(ECLIA)平行测定84例样本(其中36例甲状腺功能正常、24例甲状腺功能亢进症、24例甲状腺功能减退症), 结果2种方法之间相关性良好(Y=0.993 6X+3.401 7, r=0.983 2, P< 0.05)。

2.参考值范围的确定 252名健康人, 其甲状腺自身抗体阴性(包括甲状腺过氧化物酶抗体、甲状腺球蛋白抗体), 无甲状腺疾病史, 未触及甲状腺肿, 未服用除雌激素外的药物。采用所建方法测定上述252份样本, 结果取99%可信限, 取 x̅+2.326s, 定参考值范围为≤ 32 IU/mL。

3.临床验证 用本法测定153例甲状腺疾病患者血清样本(58例甲状腺功能亢进症、52例甲状腺功能减退症和43例甲状腺肿), 32例非甲状腺疾病患者血清样本(包括22例Ⅰ 型糖尿病患者, 10例风湿患者), 48例正常人血清样本。结果显示, 甲状腺功能亢进组和甲状腺功能减退组TPO抗体水平和阳性率显著高于其他组; 甲状腺肿组和非甲状腺疾病组TPO抗体水平与对照组比较, 差异有统计学意义(P均< 0.01)。不同试验组TPO抗体水平及其阳性率的比较见表2。

表2 不同试验组TPO抗体水平及其阳性率比较
讨 论

国内TPO抗体检测主要采用放射免疫分析法(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和ECLIA。RIA存在放射性污染、半衰期短及试剂盒稳定性差等问题。ELISA中酶标记物具有不稳定性, 且重复性和敏感性较差。ELISA和ECLIA的商品化试剂多为进口, 比较昂贵。本研究建立的TPO抗体-TRFIA具有特异性强、稳定性好、测定范围宽、操作简便、价廉等优点; 敏感性达1.0 IU/mL, 远高于ELISA(7 IU/mL, Siemens公司); 与ECLIA比对, 2种方法之间相关性良好(r=0.983 2), 与临床诊断的一致性好; 且从进口的全自动、半自动仪器到国产仪器都可以适用, 能满足从三级甲等医院到基层医院临床不同层次的需求。在国内填补了TPO抗体-TRFIA微量检测法的空白, 有良好的应用价值。

有报道, 将TPO的第590~675位氨基酸(C2)抗原区重组纯化用于固相包被, 65%的AITD患者血清中可以测到C2抗原的抗体[3], 但TPO抗体有IgG1、IgG2、IgG3和IgG4等亚型, 在健康人和AITD患者中各种亚型的分布有所不同, 此外患者和健康人体内TPO抗体的抗原结合位点及结合能力也有可能不同, 造成有些TPO抗体阳性患者的血清不能与C2区结合, 因此用全分子TPO可能更加理想。

当甲状腺发生病变, 滤泡细胞结构受到破坏时, TPO于甲状腺滤泡细胞腔的边缘即甲状腺细胞顶部向外周血溢漏, 刺激机体免疫系统产生抗甲状腺组织成分抗体即TPO抗体, 该抗体的产生与AITD有高度相关性[4]。本研究显示, 甲状腺功能亢进组和甲状腺功能减退组血清TPO抗体水平明显升高, 且阳性率较高, 与文献报道一致[5]; 在非甲状腺疾病患者中也可有轻至中度升高[6~8]。另外过多的碘摄入量也可能会影响甲状腺功能, 导致TPO抗体水平升高[9]。所以TPO抗体结果应与其他检验结果、全面的临床表现及其他可用的信息综合参考使用。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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