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方玉才, 陈闺红, 马少春, 曾瑞梅, 江敏麒, 袁柳明. 慢性乙型肝炎e抗原阴性患者病毒DNA与外膜大蛋白的相关性分析及临床意义. 2009, 24(10): 748-750
  
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慢性乙型肝炎e抗原阴性患者病毒DNA与外膜大蛋白的相关性分析及临床意义
方玉才, 陈闺红, 马少春, 曾瑞梅, 江敏麒, 袁柳明
桐庐县第一人民医院检验科,浙江 桐庐 311500

作者简介:方玉才,男,1962年生,副主任技师,主要从事临床免疫检验工作。

摘要
目的

探讨血清乙型肝炎病毒外膜大蛋白(HBV-LP)检测对判定慢性乙型肝炎e抗原(HBeAg)阴性患者病毒复制的相关性及其临床意义。

方法

分别采用酶联免疫吸附试验(ELISA)、时间分辨免疫荧光分析和实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测421例慢性HBeAg阴性患者血清中HBV-LP、HBV-M和HBV DNA,并进行相关性分析。

结果

421例慢性HBeAg阴性患者血清HBV DNA与HBV-LP 2种方法阳性和阴性的符合率为75.7%,其HBV DNA阳性检出率为53.6%,HBV-LP阳性检出率为56.5%,两者差异无统计学意义( P>0.05);在181例HBV DNA和HBV-LP共同阳性标本中,血清HBV-LP水平与HBV DNA拷贝数变化相一致,两者呈正相关( r= 0.938, P<0.01);HBV DNA阳性血清中HBV-LP阳性率为80.1%。

结论

血清HBV-LP水平能反映慢性HBeAg阴性病毒感染者体内HBV的复制程度,适合替代HBV DNA检测的方法,是对HBV-M检测的补充,可作为判断HBV复制新的血清学指标,在基层医院对慢性HBeAg阴性患者的诊治具有非常实用的临床价值。

关键词: 乙型肝炎病毒外膜大蛋白; 乙型肝炎病毒DNA; 慢性乙型肝炎e抗原; 病毒复制
中图分类号:R446.62 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2009)10-0748-03

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是一个严重的公共卫生问题。我国是HBV的高流行地区, 梁晓峰等[1]报道我国一般人群中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)携带率为9.09%, 其中慢性HBV感染者约占全世界的1/3。贾继东[2]报道我国约1/3的慢性乙型肝炎患者e抗原(HBeAg)阴性, 但仍然伴有高水平的HBV复制。目前评估HBV复制的指标主要是HBV DNA和HBeAg, 对不能进行HBV DNA检测的基层单位, HBeAg阴性的这些患者的HBV复制程度就难以判定。为了解慢性HBeAg阴性的患者血清HBV DNA与乙型肝炎病毒外膜大蛋白(hepatitis B virus Large EnveLope protein, HBV-LP )两者结果间的相关性及不同HBV DNA拷贝数与HBV-LP的相关性及临床意义, 探讨HBV-LP可否作为慢性HBeAg阴性患者病毒复制程度和临床治疗的判定指标, 我们对421例的慢性HBeAg阴性患者血清进行HBV DNA、HBV-LP的检测。

材料和方法
一、材料

1.一般资料 421例慢性HBeAg阴性患者为2006年1月至2008年12月桐庐县第一人民医院肝炎门诊和住院患者, 其中男251例, 女165例, 年龄26~71岁。慢性乙型肝炎诊断标准参照2000年中华医学会传染病与寄生虫病学会分会, 肝病学分会联合修订的“ 病毒性肝炎防治方案” 中的病毒性肝炎诊断标准[3]。

2. 标本 所有被选患者均于清晨空腹抽外周静脉血10 mL, 分离血清后分4管, 置-20℃冰箱保存备用, 分别用于生化指标、HBV DNA、HBV-LP、血清乙肝标志物检测。

二、方法

HBV DNA检测采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)方法。标本外送由杭州迪安医学检验中心检测, 检测下限为5× 102拷贝数/mL, < 5× 102拷贝数/mL判为HBV DNA阴性; HBV-LP检测用酶联免疫吸附试验(ELISA), 采用针对构象型前S区的单克隆抗体, 试剂盒由北京热景生物技术公司提供[国食药监械(准)字2008第3400992号], Cut off值为0.105; HBV血清乙肝标志物检测采用时间分辨免疫荧光分析法, 试剂盒由苏州新波生物技术有限公司提供; HBsAg> 0.5 ng/mL, HBsAb> 10 mIU/mL, HBeAg> 0.03 NCU/mL, HBeAb> 1.5 NCU/mL, HBcAb IgG> 0.1 NCU/mL和HBcAb IgM> 10 NCU/mL判定为阳性。测定均严格按照试剂盒说明书进行操作。

三、统计学方法

采用SPSS13.0软件包进行统计学分析, HBV-LP与HBV DNA的检出率用配对资料卡方检验; 计量资料组间差异采用方差分析, P< 0.05为差异有统计学意义; HBV DNA拷贝数与HBV-LP含量采用线性相关性分析。

结 果

一、421例慢性HBeAg阴性患者HBV DNA与HBV-LP检测结果, 见表1。

表1 HBV DNA与HBV-LP检测结果

从表1可见, 421例慢性HBeAg阴性患者血清中HBV DNA与HBV-LP 2种方法检测同时阳性和阴性符合率为75.7%〔(181+138)/421〕, 其中HBV DNA阳性检出率为53.6%(226/421), HBV-LP阳性检出率为56.5%(238/421), 两者差异无统计学意义(P> 0.05)。

二、421例慢性HBeAg阴性患者血清HBV DNA和HBV-LP同时阳性为181例, HBV DNA阳性拷贝数与HBV-LP的相关性, 见表2。

表2 181例HBV DNA阳性拷贝数与HBV-LP的相关性

从表2可见, 226例HBV DNA阳性标本中, 181例标本HBV-LP、HBV DNA同为阳性, 随着HBV DNA拷贝数的升高其血清HBV-LP的吸光度(A)值也呈上升趋势, 且两者之间有良好的相关性, 相关系数(r)=0.938, 回归方程为Y=0.492X-0.741, P< 0.01。不同HBV DNA拷贝数组间HBV-LP差异有统计学意义(F=94.0, P< 0.01), 这一结果说明HBV DNA拷贝数的对数值与HBV-LP A值具有相关性。

讨 论

HBV是嗜肝DNA病毒, 其S基因编码合成的HBV外膜蛋白由3种蛋白组成, 分别是主蛋白(HBsAg)、中蛋白(HBsAg、Pre-S2)和大蛋白(HBsAg、Pre-S1、Pre-S2)[4]。近年来研究表明HBV-LP存在于病毒颗粒(Dane)和亚病毒管状颗粒上, 是病毒形成完整外膜的重要指标, 其与乙型肝炎发病机制、HBV的感染、复制及其预后密切相关, 与血清HBV DNA拷贝数具有良好的相关性[5, 6, 7]。

通过对421例慢性HBeAg阴性患者的检测, 我们发现有13.5%(57/421)的患者检测结果为HBV-LP阳性而HBV DNA阴性, 分析其可能原因(1)由于HBV具有适应性和变异性倾向, 导致HBV基因变异频繁, 已经设计好的商品化PCR引物有一定的漏检率, 而HBV-LP检测是采用单克隆抗体特异设别, 受基因变异的影响较小[8]; (2)在HBV DNA阴性(< 5× 102拷贝数/mL)标本中仍可能有一定的残留病毒量; (3)目前临床上使用的抗病毒药物只能抑制HBV DNA复制, 并不能抑制已经形成的病毒表达蛋白, 而且血液中有HBV-LP的亚病毒颗粒的数量是完整病毒颗粒的10 000倍, 血液中消退时间晚于HBV DNA[9]。同样在HBeAg阴性患者中出现了10.7%(45/421)的HBV-LP阴性而HBV DNA阳性患者, , 可能原因是HBV DNA检测敏感性较高所致, 这种差异是由于方法学不同, 检测的成分和特异性不同造成的。

目前基层医院对乙型肝炎主要采用血清乙肝标志物“ 两对半” 检测, 但由于乙肝“ 两对半” 的血清免疫学标志物检测方法的敏感性、特异性的限制以及HBV为逃避宿主的免疫反应发生变异, 导致其检测结果出现假阴性。HBV DNA定量检测是直接对HBV的遗传物质DNA进行基因扩增, 是病毒复制存在的最早期、最敏感的也是最可靠的指标, 可对HBV感染者作出早期诊断, 也可用于判断乙肝患者传染性的高、低, 但由于DNA的检测需要特殊条件和仪器, 难以在基层医院普及, 给基层医疗单位对乙肝治疗方案的确定和乙肝病毒复制的判断带来很大的困难。本研究表明HBV-LP检测能够弥补目前“ 两对半” 检测的不足, 而且操作简便、快速无需特殊环境和特殊设备, 是适合替代HBV DNA检测的方法, 在基层医院对乙肝尤其是慢性HBeAg阴性患者抗病毒治疗停药时间的确定提供参考, 其具有非常实用的临床价值, 适合各级医院尤其是不具备HBV DNA检测条件的基层医院的推广应用。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] 梁晓峰, 陈园生, 王晓军, 等. 中国3岁以上人群乙型肝炎血清流行病学研究[J]. 中华流行病学杂志, 2005, 26(9): 655-658. [本文引用:1]
[2] 贾继东. 乙型肝炎e抗原阴性慢性乙型肝炎的治疗[J]. 中华肝病杂志, 2005, 13(7): 539. [本文引用:1]
[3] 中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会联合修订. 病毒性肝炎防治方案[J]. 中华传染病杂志, 2001, 19(1): 56-62. [本文引用:1]
[4] Barrera A, Guerra B, Notvall L, et al. Mapping of the hepatitis B virus pre-S1 domain involved in receptor recognition[J]. J Virol, 2005, 79: 9786-9798. [本文引用:1]
[5] Bruss V. Envelopment of the hepatitis B virus nucleoca-psid[J]. Virus Res. 2004, 106(2): 199-209. [本文引用:1]
[6] Lambert C, Mann S, Prange R. Assessment of deter-minants affecting the dual topology of hepadnavrial large envelope proteins[J]. J Gen Virol, 2004, 85(5): 1221-1225. [本文引用:1]
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[8] 魏红山, 黄玉波. e抗原阴性慢性乙型肝炎患者血清表面抗原大蛋白水平与乙型肝炎病毒DNA之间的关系[J]. 中华肝脏病杂志, 2006, 14(7): 543-544. [本文引用:1]
[9] Bruns M, Miska S, Chassot S, et al. Enhancement of hepatitis B virus infection by noninfections subviral particles[J]. J Virol, 1998, 76(8): 1462-1468. [本文引用:1]