唑类药物的作用靶位是14α-去甲基化酶,也称14-DM,由靶酶编码基因 ERG11编码。麦角甾醇是真菌细胞膜的主要甾醇,在保持膜结构的完整性、与膜结合酶的活性、细胞活力以及物质运输等方面起重要作用。14α-去甲基化酶是麦角甾醇生物合成的关键酶,唑类药物对14α-去甲基化酶有较强的亲和力,通过与靶酶结合阻止底物羊毛甾醇同14α-去甲基化酶接触,造成羊毛甾醇不能转化为麦角甾醇,导致真菌细胞膜结构破坏而抑制真菌生长^{[ 1]}。

1. ERG11基因突变 唑类药物包括咪唑类 (酮康唑、咪康唑等) 和三唑类(氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑等) ,其靶酶的编码基因—— ERG11基因突变可导致所编码的氨基酸改变,从而导致酶与药物的亲和力下降,产生耐药。有学者通过分析白念珠菌耐药株29个氨基酸置换点, 提出 ERG11基因编码蛋白氨基酸的置换点主要分布在105~165、266~ 287及405~ 488 3个热点区域^{[ 2]}。White^{[ 3]}将G129A、Y132H、S405F、G464S 和 R467K 等5个氨基酸的置换点在酿酒酵母中异体表达,结果这些氨基酸置换点影响了靶酶与唑类药物的亲和力,从而证实了 ERG11 基因突变与唑类耐药有关。14α-去甲基化酶上的F126L、T229A、G307S、F449S和I471T突变也被证实能够导致白念珠菌对氟康唑耐药^{[ 4]}。

2. ERG11基因过度表达 唑类药物靶酶基因 ERG11过度表达导致靶酶增多,细胞内药物浓度不能完全抑制靶酶活性,而使真菌产生耐药性。Kontoyiannis等^{[ 5]}对14-α去甲基化酶编码框上游的启动子GALl进行调控,不仅出现了耐药基因过度表达,而且表现为临床耐药,证实了基因过度表达导致耐药性的假说。有研究发现,锌族转录因子Upc2p的突变能够使 ERG11基因过度表达,造成耐药的产生,其失活则能引起菌株对唑类药物的超敏性^{[ 6]}。Upc2p中G648D、A643T的功能性突变,使其中一个丙氨酸被苏氨酸置换,均能使 ERG11过表达,从而使菌株耐药性增加^{[ 7]}。在敏感和耐药相配对的菌株中,Upc2p和其他同麦角固醇合成相关基因的正向调节与 ERG11相平行^{[ 8]}。但是, ERG11基因过度表达并非单独出现,多是与基因点突变、基因调节外排泵的过度表达一同出现。

主动外排使真菌细胞内药物浓度减少,其过度表达是白念珠菌对唑类耐药的主要机制之一。目前已知与白念珠菌耐药有关的外排泵有以下两大类。

一类是含ATP结合区的ABC转运蛋白超家族,他们通过结合并水解ATP为跨膜转运提供能量,这类转运蛋白广泛存在于哺乳动物、细菌和真菌等细胞中,在白念珠菌中的转运蛋白统称为白念珠菌耐药蛋白( Candida albicans drug resistant protein,Cdrp)^{[ 9]}。目前已鉴定出10种Cdrp,分别为外排泵蛋白编码基因 CDR1 ~CDR10所编码,但其中只有 CDR1和 CDR2与其耐药性产生有关。其过度表达可以促使白念珠菌对唑类药物耐药性的产生,这些基因的缺失可导致对唑类药物的超敏感性^{[ 10]}。转录活化因子在多药转运蛋白编码基因的过度表达中发挥重要作用,属于锌族转录因子家族成员。其中转录活化因子 (transcriptional activator of cdr genes 1, TAC1)被证实是介导白念珠菌耐药基因调控的转录活化因子,是 CDR1和 CDR2基因表达上调的必需因子^{[ 11]}。TAC1野生型的等位基因在诱导剂如氟奋乃静等的存在下可以引起 CDR1、 CDR2表达的上调,而TAC1功能亢进的等位基因能引起 CDR1、 CDR2的持续性高表达,从而引起耐药^{[ 12]}。对敏感株和耐药株的 TAC1基因进行检测,发现敏感株皆为野生型等位基因,而耐药株则是功能亢进的等位基因。有研究发现,当 TAC1上存在功能获得性突变,即单个碱基突变导致氨基酸改变或框内缺失,将功能获得性突变 TAC1基因导入唑类药物敏感的白念珠菌中表达时,可导致 CDR1及 CDR2高表达而产生耐药,将该突变的 TAC1基因敲除则耐药性消失^{[ 13]}。至今已发现的功能获得性突变位点共有16个,分布于12个不同的氨基酸位点^{[ 14]}。另外还有转录因子FCR1,Talibi 等^{[ 15]}发现,将白念珠菌中的 FCR1基因敲除后, CDR1和 CDR2表达量增高,菌株出现耐药性。证明在氟康唑诱导的条件下, FCR1基因能够负向调控多药耐药基因 CDR1和 CDR2的表达,从而促进白念珠菌对药物的外转运功能,使菌株产生耐药。

另一类是易化扩散载体超家族(major facilitator superfamily, MFS),在白念珠菌中包括多耐药转运蛋白(multidrug resistant transporter,Mdrlp)和易化扩散超家族转运蛋白(facilitator superfamily transporter,Flulp),编码基因分别为 MDR1和 FLU1,不依赖能量载体,通过与细胞外H⁺交换将药物转运到细胞外。 MDR1过度表达使生成的多药运载体将细胞内的药物泵出到胞外,导致耐药的发生。 FLU1 编码的产物与 MDR1 编码的转运蛋白氨基酸序列相似,将其在酿酒酵母中表达时对唑类药物的耐药性提高。在白念珠菌株中,删除这2个基因皆可提高药物敏感性,结果提示 MDR1和 FLU1可能与白念珠菌耐药有关。有研究显示,在 MDR1基因中发现的功能获得性突变导入敏感菌株中可引起 MDR1持续高表达并产生耐药。由此可以认为多耐药调节基因(multidrug resistance regulator 1, MRR1)的功能获得性突变是 MDR1高表达的重要原因。现今发现的 MDR1基因的功能获得性突变共有14个,分属于13个不同的氨基酸位置^{[ 16]}。

细胞应激反应是通过增强细菌对药物的抵抗力产生耐药。其耐药机制包括两方面,降低药物对细胞的影响和细胞通过应激反应抵抗药物的作用。如转录因子MDR1除了调节靶酶MDR1,还调节氧化还原酶,减少毒性分子对细胞产生药物性损害^{[ 17]}。TAC1还能以应激反应调节谷胱甘肽过氧化物酶、神经鞘氨醇激酶和磷酸酶,促成对氧化的压力反应和脂质新陈代谢的改变,从而导致对唑类的耐药。

神经钙蛋白不是标准实验室条件下白念珠菌生长的必要条件,但应对外界压力,如暴露于血浆中和碱性环境中会产生重要的反应。有研究证实,免疫抑制剂环孢菌素A和FK506能够特异地作用于神经钙蛋白介导唑类耐药的产生,而且神经钙蛋白还通过使靶酶的编码基因 ERG3失活,阻止有毒甾醇的堆积导致对唑类耐药^{[ 18]}。钙调锌族转录因子(calcineurin-responsive zinc finger transcription factor,CRZ1)是神经钙蛋白的下游因子,在神经钙蛋白作用下,活化了一系列信号通路因子表达,参与离子的运输、保持细胞壁的完整性和小囊的运输等。敲除 CRZ1基因则菌株对唑类药物中度敏感,而加入神经钙抑制剂会使敏感性增强,说明不但 CRZ1基因对唑类药物耐药有影响,而且还有其他神经钙介导的下游因子与唑类药物耐药有关^{[ 19]}。

蛋白激酶2是另一个在导致唑类药物耐药中起重要作用的信号分子, CKA2 和其同系物 CKA1编码蛋白激酶2的催化亚单位。有研究表明, CKA2的突变使 CDR1和 CDR2过表达,从而导致唑类药物耐药,而这种反应又可被 CKA1的过表达抑制。

生物膜是微生物黏附于宿主机体或物体表面后形成的细胞外聚合物基质(exopolymeric matrix,EPM),是微生物在自然状态下的生存方式。产生生物膜的微生物对绝大多数抗菌药物都具有较强的耐药性。目前对生物膜耐药机制的研究主要有以下几方面:(1)细胞外基质阻碍药物渗入。生物膜的主要组成成分为β-葡聚糖,其将菌细胞群落包裹起来形成一个物理屏障,阻止或延迟了药物的渗入。有研究表明,β-葡聚糖可以螯合唑类抗真菌药物,称之为“药物海绵”,是白念珠菌生物膜耐药的最主要原因^{[ 20]};(2)膜内真菌细胞的低生长率产生耐药。由于生物膜内的白念珠菌细胞生长速度缓慢,对药物摄入的速度和摄入量也降低,所以药物作用效果不佳;(3)细胞膜的脂质成分改变对耐药性的影响。Khot等^{[ 21]}发现,生物膜底部芽孢层的细胞耐药性比上层的菌丝相和酵母相的细胞高出10倍以上,对生物膜芽孢层细胞的麦角固醇合成相关酶的基因进行实时荧光定量分析时,发现它们与高耐药性存在相关。但这种变化是否影响到白念珠菌细胞膜对药物的渗透性还有待进一步研究;(4)生物膜药物外排泵相关基因的表达。生物膜药物外排泵基因主要包括 CDR1、 CDR2、 MDR1,有研究表明在生物膜形成过程中这些基因均有表达,当菌细胞暴露于抗真菌药物中时出现表达上调^{[ 22]}。动物实验研究表明,植入导管12 h, CDR2基因表达上调1 .5倍, MDR1则出现短暂上调,在12和24 h分别上调2.1倍和1.9倍^{[ 23]}。现有研究表明,生物膜的耐药是多个因素共同作用的结果,但还有尚未明确的因素^{[ 24]}。

白念珠菌对唑类的耐药是真菌耐药的主要因素,其耐药性已成为亟待解决的问题。虽然其耐药机制复杂,但随着分子生物学技术水平的不断进步,对其机制探究的视野也在不断拓宽。了解真菌的耐药机制对改善药物药学特性和临床用药方法有所帮助。