引用本文
何林燕, 杨翠霞, 王文涓, 杜艳, 刘鷖雯, 何怡青, 高锋. 肿瘤相关巨噬细胞诱导乳腺癌耐药的实验研究. 2014, 29(9): 903-908[HE Linyan, YANG Cuixia, WANG Wenjuan, DU Yan, LIU Yiwen, HE Yiqing, GAO Feng. Investigation on the determination of tumor-associated macrophages inducing the drug resistance of human breast cancer. Labratory Medicine, 2014, 29(9): 903-908]  
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肿瘤相关巨噬细胞诱导乳腺癌耐药的实验研究
何林燕1, 杨翠霞2, 王文涓2, 杜艳2, 刘鷖雯2, 何怡青2, 高锋2
1. 苏州大学研究生部,江苏 苏州 215006
2.上海交通大学附属第六人民医院中心实验室, 上海 200233

作者简介:何林燕,女,1988年生,硕士,主要从事肿瘤免疫治疗研究。

摘要
目的

探索肿瘤相关巨噬细胞(TAM)在乳腺肿瘤细胞耐药中的作用及其耐药机制。

方法

通过佛波酯(PMA)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素13(IL-13)刺激人单核细胞白血病细胞系THP-1,建立TAM模型在体外与乳腺癌细胞共培养,运用流式细胞术(FCM)检测TAM表面分子CD14、CD204;使用噻唑蓝(MTT)比色法检测紫杉醇对乳腺癌细胞系T47D、BT-549的有效杀伤浓度和时间,以及乳腺癌细胞单独培养、乳腺癌细胞与TAM/TAM上清共培养下乳腺癌细胞的杀伤;运用Western blot检测肿瘤细胞的磷酸化信号转导与转录激活因子3(p-STAT3)、磷酸化c-jun氨基末端激酶(p-JNK)信号通路变化。

结果

THP-1细胞经PMA、IL-4、IL-13诱导分化为TAM,其细胞表面表达CD14、CD204(表达率分别为31.52%±9.39%、48.21%±8.76%)。TAM/TAM上清与肿瘤细胞共培养均可显著削弱紫杉醇对肿瘤细胞的杀伤(T47D相对存活率由43.52%±9.40%提高至92.68%±2.32%/92.20%±2.10%,BT-549相对存活率由63.08%±2.71%提高至77.96%±2.64% /79.55%±2.35%,P<0.05),明显下调其凋亡信号p-JNK(P<0.05),同时显著上调p-STAT3 (P<0.05)。

结论

成功建立TAM模型,TAM介导乳腺肿瘤细胞耐药,其机制可能与TAM分泌的细胞因子影响肿瘤细胞STAT3、JNK信号分子磷酸化有关。

关键词: 肿瘤相关巨噬细胞; 乳腺癌; 耐药; 紫杉醇
中图分类号:R446.61 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2014)09-0903-06
Investigation on the determination of tumor-associated macrophages inducing the drug resistance of human breast cancer
HE Linyan1, YANG Cuixia2, WANG Wenjuan2, DU Yan2, LIU Yiwen2, HE Yiqing2, GAO Feng2
1. Graduate Faculty, Soochow University, Jiangsu Suzhou 215006, China
2. Center for Clinical Laboratory, Shanghai Jiaotong University Affiliated Sixth People's Hospital, Shanghai 200233, China
Abstract
Objective

To investigate the role and drug resistance mechanism of tumor-associated macrophages (TAM) in human breast cancer cells.

Methods

Human monocytic cell line THP-1 was stimulated by phorbol myristate acetate (PMA), interleukin 4 (IL-4) and interleukin 13 (IL-13) to build a model of TAM which was cocultured with breast cancer cells in vitro. Flow cytometry (FCM) was used to determine CD14 and CD204. The effective concentration and time of paclitaxel for inhibiting the proliferation of breast cancer cell line T47D and BT-549, and the inhibitory rates of breast cancer cell cultured alone and cocultured with TAM/TAM conditioned medium were detected by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) colorimetric signal. The signal pathway change of phosphorylated signal transducers and activators of transduction 3 (p-STAT3) and phosphorylated c-Jun N-terminal kinase (p-JNK) were analyzed by Western Blot.

Results

THP-1 differentiated to TAM by PMA, IL-4 and IL-13 and showed the expressions of CD14 (31.52%±9.39%) and CD204 (48.21%±8.76%). Breast cancer cell lines which had been cocultured with TAM/TAM conditioned medium showed a significant increase in the number of survival cells compared to breast cancer cell lines cultured alone (T47D cultured alone:43.52%±9.40%, T47D cocultured: 92.68%±2.32%/92.20%±2.10%, BT-549 cultured alone: 63.08%±2.71%, BT-549 cocultured: 77.96%±2.64%/79.55%±2.35%,P<0.05). The apoptosis signal p-JNK was significantly down-regulated (P<0.05), and the p-STAT3 was up-regulated (P<0.05).

Conclusions

The model for TAM is established successfully. TAM protects breast cancer cells from the effect of paclitaxel through the secretion of cytokines which may caused by the activation of STAT3 and down regulation of p-JNK in tumor cells.

Keyword: Tumor-associated macrophage; Breast cancer; Drug resistance; Paclitaxel

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,然而乳腺肿瘤耐药是临床治疗的难点,严重影响患者预后,目前尚缺乏有效解决肿瘤耐药的方法。有研究发现,在乳腺癌基质中存在大量肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage,TAM)[ 1],TAM来源于血液循环中的单核细胞,在肿瘤微环境中分化成为M2表型的巨噬细胞,是肿瘤基质中的主要炎症细胞群,可占乳腺癌基质细胞群体的50%~80%[ 2],TAM抗原递呈能力弱,因此不能正常呈递肿瘤抗原进行免疫应答等反应。有研究发现,TAM与肿瘤免疫逃逸有关[ 3],同时临床数据证实TAM数量与肿瘤预后呈负相关[ 4]。在实体瘤的环境中,TAM可促进肿瘤浸润转移,抑制T细胞和自然杀伤(natural killer,NK)细胞的抗肿瘤活性,减弱急性期炎症反应,从而促进肿瘤进展[ 5]。迄今为止,TAM在乳腺肿瘤耐药方面的作用研究尚少。因此本研究选取人单核细胞白血病细胞系THP-1,经替代激活途径获得TAM,建立TAM与乳腺肿瘤细胞系直接接触以及非直接接触共培养体系,探索TAM在肿瘤耐药中的作用及其相应机制,为临床治疗提供理论依据。

材料和方法
一、材料

人单核细胞白血病细胞系THP-1以及人乳腺肿瘤细胞T47D 、BT-549均购自中国科学院典型培养物保藏委员会。RPMI1640培养液(Gibco,美国),胎牛血清(上海洛神生物),佛波酯(phorbol myristate acetate, PMA,Merck),重组人白细胞介素4(interleukin 4,IL-4)、重组人白细胞介素13(interleukin 13, IL-13,Peprotech),别藻蓝蛋白(allophycocyanin,APC)标记的鼠抗人CD14及其同型抗体(eBioscience,美国),藻红蛋白(phycoerythrin,PE)标记的鼠抗人CD204及其同型抗体(R&D,美国),噻唑蓝[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT,Amresco],紫杉醇(paclitaxel, 上海英轩医药科技有限公司),Phospho- Tyr705 STAT3、Phospho- Thr183/Tyr185 JNK抗体(Cell Signaling Technology)。

二、方法

1. 细胞培养 T47D细胞用含10%胎牛血清、20 U/mL胰岛素的RPMI1640培养基常规培养,BT-549细胞用含10%胎牛血清、0.023 U/mL胰岛素的RPMI1640培养基常规培养, THP-1细胞在含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中常规培养,条件均为5% CO2、37 ℃、饱和湿度。BT-549、T47D均为贴壁生长,THP-1为悬浮生长。所有细胞均在30代以内。

2. TAM的体外替代激活 取生长对数期的THP-1细胞离心收集后,重悬于含320 nmol/L PMA的有血清培养液中,37 ℃、5% CO2、松盖培养48 h待THP-1贴壁,加入20 ng/mL IL-4、IL-13,松盖培养72 h即可获得TAM。

3. TAM上清的获取 按上述方法获得TAM后,弃上清,换成正常完全培养液培养72 h后收集上清,离心弃沉淀,过滤除去细胞碎片。

4. 流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测TAM表面标记分子CD14、CD204 取诱导后的THP-1细胞,磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline, PBS)洗涤后0.25%胰酶消化成单细胞悬液,离心收集细胞,弃上清,适量PBS洗涤,修正细胞数至1×106个后重悬于100 μL PBS,实验组加入5 mL CD14抗体或10 μL CD204抗体,对照组加入同体积的同型对照抗体。室温避光放置45 min,PBS洗涤2次后重悬于500 μL PBS,移至流式管中后使用Beckman Coulter Navios流式细胞仪检测。

5. 紫杉醇的配制 称量1 mg紫杉醇溶解于60 μL 无水乙醇中,以RPMI1640稀释成2×107 nmol/L的母液,0.22 μm滤器过滤除菌后用RPMI1640稀释成所需的工作浓度。

6. MTT比色法检测紫杉醇在体外对乳腺癌细胞的杀伤作用 取对数生长期的T47D、BT-549细胞,0.25%胰酶消化后用RPMI1640培养液制成单细胞悬液。调整细胞浓度为6×104/mL,接种于96孔培养板,每孔100 μL,于37 ℃、5% CO2 培养箱中培养24 h。实验设空白对照组和药物处理组,药物处理组分别加入含紫杉醇的RPMI1640培养液,紫杉醇终浓度分别为6.25、12.5、25、50、100 nmol/L 5个浓度梯度。每个实验组每个时间点设10个复孔,继续培养24、48和72 h后,各孔加入溶于RPMI1640的MTT溶液(5 mg/mL) 20 μL,继续培养4 h,取出置离心机中以3 000× g离心5 min,吸弃上清,每孔加入二甲亚砜(dimethylsulfoxide, DMSO)100 μL,待结晶溶解后酶标仪检测570 nm波长下的吸光度( A)值,计算细胞抑制率。以上实验重复3次。细胞抑制率(%)=( A对照组 -A实验组) /A对照组×100%。

7. 共培养体系中肿瘤细胞的抑制率检测 TAM与肿瘤细胞直接接触共培养如下:在96孔板中接种TAM,TAM与肿瘤细胞数目按1∶0.5比例接种肿瘤细胞,待肿瘤细胞贴壁后加入紫杉醇共培养48 h,每组设6个复孔[ 6]。非直接接触共培养方法如下:在96孔板中接种肿瘤细胞,培养液为TAM上清,待肿瘤细胞贴壁后加入紫杉醇共培养48 h,加入MTT溶液继续培养4 h,离心后小心吸弃上清,每孔加入DMSO 100 μL,震荡10 min,待结晶充分溶解后上酶标仪检测570 nm波长下的 A值,计算细胞抑制率。以上实验重复3次。实验分组:实验随机分为8组(即A组:单独肿瘤细胞对照组;B组:肿瘤细胞与THP-1共培养对照组;C组:肿瘤细胞与TAM共培养对照组;D组:肿瘤细胞与TAM上清共培养对照组;E组:肿瘤细胞加药组;F组:肿瘤细胞与THP-1共培养加药组;G组:肿瘤细胞与TAM上清共培养加药组;H组:肿瘤细胞与TAM共培养加药组)。

8. Western blot检测细胞磷酸化信号转导与转录激活因子3(phosphorylated signal transducers and activators of transduction 3, p-STAT3)、磷酸化c-jun氨基末端激酶(phosphorylated c-Jun N-terminal kinase, p-JNK)信号通路 提取细胞总蛋白,测定蛋白浓度后行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳,将分离胶按照蛋白Marker的位置切下含有目的蛋白的区域,以100 V电压转移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride, PVDF),封闭液封闭1 h后加入一抗(p-STAT3抗体1∶2 000稀释,p-JNK抗体1∶1 000稀释),于4 ℃过夜,洗膜后加入1∶10 000稀释的二抗室温孵育1 h。再次洗膜后用电化学发光试剂盒检测p-STAT3信号。

三、统计学方法

所测数据用SPSS 17.0和GraphPad Prism 5软件进行分析,检测结果以 ±s表示,多组间比较采用单因素方差分析,LSD进行两两比较,以 P<0.05为差异有统计学意义。

结果
一、THP-1诱导成TAM的细胞形态变化

THP-1为悬浮生长,经PMA刺激后贴壁生长,细胞体积变大,呈圆形或椭圆形,可有伪足伸出,加入IL-4、IL-13后细胞多呈梭形,见图1。

图1 细胞形态变化(40×)

二、THP-1细胞经诱导后表面分子CD14和CD204的检测

320 nmol/L PMA诱导THP-1细胞48 h分化成为巨噬细胞时,细胞表面出现巨噬细胞分子标志物CD14。于巨噬细胞培养液中加入20 ng/mL IL-4、IL-13作用72 h后,巨噬细胞进一步分化成为TAM,细胞表面出现CD204,见图2。THP-1经诱导后CD14的表达率为31.52%±9.39%、CD204的表达率为48.21%±8.76%,未经诱导的THP-1其CD14、CD204表达率均低于2%,呈阴性。

图2 FCM检测细胞表面标志物CD14和CD204的表达

三、紫杉醇对乳腺癌细胞的杀伤作用

紫杉醇分别作用于T47D、BT-549细胞24、48和72 h后,紫杉醇对于2种乳腺癌细胞的增殖抑制作用明显增加( P<0.05),见图3a、图3b,且呈时间、剂量依赖性,选择接近半数致死量的50 nmol/L作为最终浓度进行后续实验。

图3 紫杉醇对乳腺癌细胞的增殖抑制作用

四、TAM及TAM上清对乳腺癌细胞耐药的影响

50 nmol/L紫杉醇作用于肿瘤细胞单独培养组和共培养组48 h,单独培养组显示紫杉醇能有效杀伤肿瘤细胞(T47D相对存活率为43.52%±9.40%,BT-549相对存活率为63.08%±2.71%),共培养组显示TAM及TAM上清可显著减弱紫杉醇对乳腺癌细胞的增殖抑制作用,降低肿瘤对药物的敏感性[T47D相对存活率(TAM/TAM上清)为92.68%±2.32%/92.20%±2.10%,BT-549相对存活率(TAM/TAM上清)为77.96%±2.64%/79.55%±2.35%, P<0.05],见图3c、3d。

五、TAM上清影响乳腺癌细胞耐药的分子机制研究

Western blot检测p-JNK信号结果显示,生长于正常完全培养液及TAM上清时T47D、BT-549的凋亡信号p-JNK有微弱磷酸化或无磷酸化,紫杉醇作用于乳腺癌细胞后,细胞内的p-JNK磷酸化水平显著上调( P<0.05),见图4。而紫杉醇与TAM上清共同作用于乳腺癌细胞,乳腺癌细胞的p-JNK磷酸化水平显著低于紫杉醇处理组( P<0.05)。p-STAT3信号检测结果显示,无任何因素作用或仅有TAM上清作用于T47D、BT-549时,细胞内p-STAT3处于高磷酸化状态;紫杉醇作用于乳腺癌细胞后,细胞内的p-STAT3磷酸化水平显著下调( P<0.05);当紫杉醇与TAM上清2个因素共同作用于肿瘤细胞,p-STAT3磷酸化水平高于紫杉醇处理组( P<0.05)。

图4 Western blot测定细胞p-JNK、p-STAT3信号

讨论

肿瘤耐药是临床化疗药物治疗的难点,目前乳腺癌主要耐药机制有耐药蛋白过度表达、抗凋亡基因异常激活等。免疫抑制性细胞TAM在肿瘤耐药方面的作用鲜有研究。本研究根据实验室前期实验结果[ 7],筛选出对紫杉醇敏感性不同的2株乳腺癌细胞系——敏感性强的T47D和敏感性弱的BT-549。本实验使用一定浓度的PMA、IL-4、IL-13刺激THP-1分化为TAM[ 8],以模拟肿瘤微环境中的TAM,并且其细胞表面出现单核巨噬细胞分子标志物CD14、TAM分子标志物CD204[ 9]。当紫杉醇作用于单独培养的T47D、BT-549细胞时,可显著杀伤肿瘤细胞,其中T47D相对存活率为43.52%±9.40%,BT-549为63.08%±2.71%。TAM与2株乳腺肿瘤细胞系直接接触共培养后,能显著削弱紫杉醇对肿瘤细胞的杀伤,T47D存活率升高至92.68%±2.32%,BT-549存活率升高至77.96%±2.64%。而阴性对照组THP-1对乳腺癌细胞耐药无明显作用。为深入探索TAM影响肿瘤细胞耐药的机制,本实验用TAM上清与肿瘤细胞共培养,即建立间接接触共培养体系,也发现了诱导乳腺癌细胞耐药现象,提示TAM与乳腺癌细胞的直接相互作用并非肿瘤耐药唯一的作用方式。

THP-1经PMA诱导成为巨噬细胞可作为模型用于研究巨噬细胞[ 10],再经过IL-4、IL-13可诱导激活成为具有M2表型的TAM[ 5, 9, 11],如表达CD14、CD204、CD163等。巨噬细胞经不同诱导剂刺激可分化为不同亚型的TAM,包括M2a、M2b、M2c,如IL-4、IL-13可诱导获得M2a,免疫复合物与脂多糖共同刺激可获得M2b,白细胞介素10(interleukin 10,IL-10)可诱导获得M2c[ 5]。不同亚型可表达不同的表面分子,并均呈现低表达白细胞介素12(interleukin 12,IL-12)、高表达IL-10。不同亚型之间有着相同的生物学功能,如低抗原递呈能力、组织修复、伤口愈合、肿瘤生长转移,但TAM介导肿瘤耐药机制尚不清楚。JNK信号转导通路是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路的一个重要分支,它在细胞周期、增殖、凋亡和细胞应激等多种生理和病理过程中起重要作用。本实验显示紫杉醇作用于T47D、BT-549细胞,凋亡信号JNK磷酸化水平明显升高;而紫杉醇与TAM上清2个因素共同作用于乳腺癌细胞时,JNK磷酸化恢复低水平。结果提示,TAM与肿瘤耐药有关,可能主要通过下调JNK凋亡信号促进乳腺癌细胞耐药。同时,STAT3是转录信号转导子与激活子家族的重要成员,它的持续激活可致肿瘤细胞中细胞周期调控因子及抗凋亡蛋白上调。磷酸化的STAT3及其目的基因在耐药细胞中异常激活或过度表达,可增强肿瘤的耐药性[ 12]。因此本实验进一步探寻STAT3与TAM诱导肿瘤耐药的关系。乳腺癌细胞系在正常培养、TAM上清培养条件下p-STAT3处于激活状态。当药物作用于正常培养条件下,乳腺癌细胞STAT3磷酸化水平显著下降,而药物作用于TAM上清培养条件下,乳腺癌细胞STAT3仍维持高水平磷酸化。本实验提示TAM耐药机制可能为TAM上清通过上调肿瘤细胞STAT3信号通路帮助肿瘤细胞逃脱药物杀伤。

本研究证实,THP-1经PMA诱导、IL-4和IL-13体外替代激活所获得的M2a型TAM自身或上清可介导乳腺癌细胞耐药,但该TAM分泌何种因子从而介导肿瘤细胞耐药及其机制有待于后续研究。此外,乳腺癌微环境中存在的TAM亚型型别及其在乳腺癌耐药机制中所起的作用亦有待深入研究。本研究以TAM为肿瘤耐药机制的切入点,提示TAM在耐药方面具有一定作用,这为肿瘤免疫治疗提供了新的思路。

The authors have declared that no competing interests exist.

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