选择2011年1月至2013年6月北京军区总医院全军肝病治疗中心住院的PHC患者148例作为研究对象,男87例,女61例,年龄45~69岁,入组患者均经超声或计算机断层扫描等影像学检查证实肝脏有实性占位性病变,伴或不伴AFP阳性,同时经肝组织活检病理检查确诊,肝功能A级或B级,诊断符合卫生部“原发性肝癌诊断规范(2011年版)”诊断标准^{[ 5]}。肝硬化(liver cirrhosis, LC)患者73例,男52例,女21例,年龄52~79岁;慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者57例,男33例,女24例,年龄47~76岁,诊断符合2010年中华医学会肝病学分会、感染学分会“病毒性肝炎防治指南”中病毒性肝炎诊断标准。另选择85名健康人作为正常对照组,男56名,女29名,年龄43~68岁,经检测各型肝炎病毒标志物及AFP均为阴性,无心、肝、肺、肾功能异常。对4组研究对象年龄、性别等进行比较,差异均无统计学意义( P均>0.05)。

血清GP73检测采用ELISA,试剂盒由北京热景生物技术有限公司提供,参考值≥150 μg/L为PHC阳性^{[ 6]};血清GPC3 ELISA试剂购自美国Gusabio Biotech公司,参考值≥9.5 μg/L为PHC阳性,ELISA仪为美国伯乐550型酶联仪。血清AFP检测使用美国雅培AXSYM免疫化学发光分析仪及同型配套试剂,参考值≥120 μg/L为PHC阳性。受检者在入院后均清晨空腹采集静脉血3 mL,不抗凝,500× g离心5 min,留取血清转移至另一清洁的EP管内,放置-80 ℃冰箱内低温保存,统一检测。

采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析。计量数据用 ±s表示,多组比较采用方差分析,组间两两比较采用 q检验;计数资料用百分率表示,组间比较采用 χ²检验。以 P<0.05为差异有统计学意义。

目前对PHC的诊断依然依据病理及影像学诊断技术,但仅靠影像学检查对肝内的良恶性病变鉴别很困难,尤其是肝癌与肝炎后肝硬化造成的结节性改变不易鉴别。我国的PHC患者绝大多数基于长期慢性肝炎、肝硬化患者,在这些高危人群中早期发现PHC并及时治疗可明显提高5年生存率^{[ 7]}。血清肿瘤标志物可以在影像学发现PHC之前异常表达,对恶性肿瘤的发现起到监测和预警作用。因此,探讨AFP联合多种肿瘤标志物检测提高PHC检出率非常必要。

GP73是存在于高尔基体上的一种Ⅱ型跨膜糖基化修饰蛋白,含400个氨基酸,在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyaorylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)中显示其相对分子质量为7.3×10⁴。近期的研究发现在PHC患者的胆管上皮细胞中GP73呈高水平表达,参与细胞黏附及信号传导,影响蛋白质的分泌和稳定性,参与机体的免疫调节及炎症反应^{[ 8]}。Marrero等^{[ 9]}研究发现在肝癌患者血清中,GP73水平显著升高,而在正常人肝细胞中表达很少,甚至不表达。近一步的研究发现,其在PHC患者中表达明显上调,与乙型肝炎、丙型肝炎、酒精性LC及自身免疫学性肝炎引起的肝损伤有明显差异^{[ 10, 11]},对于PHC患者的早期诊断及鉴别诊断具有重要临床意义。

本研究结果显示,GP73在PHC患者血清中显著升高,PHC组与LC、CHB及正常对照组比较,差异有统计学意义( P均<0.01),证实血清GP73对PHC的诊断是一个较好的检测指标。这主要是因为PHC时,大量GP73由肝癌细胞或胆管上皮细胞合成并分泌到血液中,从而促使血清中GP73水平显著升高。本研究中LC和CHB患者GP73亦有升高,但明显低于PHC组,且阳性检出率很低,显示出GP73可作为PHC敏感的诊断标志物,此结果与国内外文献报道相一致^{[ 12, 13, 14]}。杨颖等^{[ 15]}研究显示在PHC和LC的诊断中,血清GP73检测与AFP的诊断效能相似,LC患者的GP73表达水平明显高于无LC的患者,小肝癌(≤3 cm)患者GP73水平高于大肝癌(≥6 cm)患者,差异具有统计学意义( P均<0.01)。结果似乎显示出GP73检测具有对PHC早期诊断的价值。Tian等^{[ 16]}研究发现GP73与AFP联合可作为肝脏疾病的检测指标,尤其可以提高AFP阴性PHC患者的检出率,并能为慢性肝损伤及LC的鉴别诊断提供依据。本研究结果发现GP73诊断PHC的效能与AFP是否升高并无明显关系,AFP阴性的PHC患者,血清GP73亦可以升高;LC和CHB患者由于存在肝细胞的损伤,血清GP73水平一度处于低水平表达并与PHC表达常有较多重叠,但无诊断价值。因此,GP73检测可以帮助诊断AFP阴性的PHC;同时对于CHB、LC患者与PHC的鉴别诊断可提供参考。

GPC3属于膜性硫酸乙酰肝素类糖蛋白超家族成员,是由蛋白质、脂类和糖三者共价连接的复杂糖复合物,其氨基端(N)为可溶性蛋白,在肝癌细胞中表达时可分泌至外周血液中^{[ 17]},这是外周循环血液中能够检测到GPC3的分子生物学基础。临床基础研究显示,肝细胞发生癌变时GPC3可异常表达,激活的 GPC3可通过多种信号传导通路促进肝细胞恶性转化,增强其侵袭转移能力^{[ 18, 19]}。研究者可利用血清学方法检测肝癌高危人群血清中GPC3表达水平的变化,探索GPC3表达与肝癌发生、发展及临床预后的相关性,从而为PHC的诊断及预后判断提供帮助。

本研究采用ELISA分别检测了PHC、LC和CHB患者及正常人群血清中GPC3表达水平,结果显示PHC组血清GPC3呈高表达,而在LC、CHB及正常对照组呈低表达,甚至无表达。江枫等^{[ 20]} 应用ELISA检测发现PHC患者血清GPC3浓度高于肝炎后LC、CHB患者及健康对照组( P均<0.01);诊断PHC的敏感性和特异性分别为85.4%和98.9%;进一步的研究发现,GPC3能显著提高小肝癌与肝硬化结节的鉴别诊断。Yao等^{[ 21]} 研究发现PHC患者血清中CPC3分布量与AFP不具有相关性。最近有研究报道,GP73与AFP检测对PHC的诊断具有较好的一致性,且在诊断小肝癌方面GP73优于AFP,但CPC3检测对PHC诊断无意义(ROC曲线下面积为0.43)^{[ 22]}。本研究显示GPC3与GP73和AFP相比在PHC患者血清中表达水平较低,但与LC和CHB患者血清中表达水平相比差异仍具有统计学意义( P均<0.01),同时发现在AFP低水平表达的PHC患者血清中GPC3表达水平也比较高。本研究结论与Wang等^{[ 22]}的报道不一致,分析原因可能与入选病例资料及检测试剂的来源不同有关。因此,对于GPC3在PHC患者的表达特征及其临床价值尚需大样本、多中心的实验数据进行深入研究。

近年来的研究表明,多种肿瘤标志物与AFP联合检测可相互弥补单一检测的不足,从而提高PHC的诊断效能。有研究将AFP-L与GP73和GPC3联合可明显提高PHC的检出率,对PHC的早期诊断具有重要的临床意义^{[ 23]}。本研究探讨了GP73、GPC3与AFP联合检测对PHC的诊断价值,3项联合检测对PHC诊断的敏感性为95.9%,明显高于AFP单项检测的76.4%( P<0.01);同时3项联合检测准确性为89.2%,而特异性仍可维持在较高水平。结果提示GP73单项检测用于PHC的诊断优势可能并不十分明显,而与AFP等3项指标联合检测可明显提高PHC的诊断效率,特别是对于无临床症状或体征及AFP阴性PHC患者的诊断具有较高的临床价值^{[ 24]}。本研究结果表明GP73、GPC3联合AFP检测可明显提高PHC的诊断率,具有较好的临床应用价值。