引用本文
乔昀, 赵英妹, 仲俊, 张珏, 龚捷文. 实时荧光定量PCR在快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中的评价与应用. 检验医学,2014, 29(7): 745-749[QIAO Yun, ZHAO Yingmei, ZHONG Jun, ZHANG Jue, GONG Jiewen. Application and evaluation of real-time fluorescence quantitation PCR in rapid determination of methicillin-resistantStaphylococcusaureus . Labratory Medicine, 2014, 29(7): 745-749]  
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实时荧光定量PCR在快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中的评价与应用
乔昀1, 赵英妹1, 仲俊1, 张珏1, 龚捷文2
1.上海中医药大学附属曙光医院检验科,上海 200021
2. 上海中医药大学附属曙光医院院内感染科,上海 200021
摘要
目的

评价实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)在快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)中的临床应用价值。

方法

经培养鉴定的70例已知细菌中22例为MRSA,48例为非MRSA,对已知细菌用实时荧光定量PCR进行检测,了解该方法的特异性和敏感性。对临床88例医护人员和患者的鼻拭子进行实时荧光定量PCR检测,了解医院内MRSA的携带情况。

结果

培养为MRSA,实时荧光定量PCR检测结果均为MRSA,敏感性为100%;培养为非MRSA,实时荧光定量PCR检测结果均为非MRSA,特异性为100%。实时荧光定量PCR检测MRSA的敏感性可确定为1×103 cfu/mL。 48例患者的鼻拭子mecA耐药基因阳性26例,金黄色葡萄球菌阳性28例,两者同时阳性(即为MRSA)20例,MRSA阳性检出率为41.6%; 40例医护人员鼻拭子mecA耐药基因阳性12例,金黄色葡萄球菌阳性13例,两者同时阳性(即为MRSA)9例,MRSA阳性检出率为22.5%。

结论

实时荧光定量PCR可用于临床对MRSA的快速检测。

关键词: 实时荧光定量聚合酶链反应; 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌; 快速检测
中图分类号:R446.5 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2014)07-0745-05
Application and evaluation of real-time fluorescence quantitation PCR in rapid determination of methicillin-resistantStaphylococcusaureus
QIAO Yun1, ZHAO Yingmei1, ZHONG Jun1, ZHANG Jue1, GONG Jiewen2
1. Department of Clinical Laboratory, Shuguang Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200021,China
2. Department of Nosocomial Infection, Shuguang Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200021,China
Abstract
Objective

To evaluate the clinical application significance of real-time fluorescence quantitation polymerase chain reaction (PCR) in rapid determination of methicillin-resistantStaphylococcusaureus (MRSA).

Methods

Among 70 cultured and identified samples of known bacteria, 22 samples were MRSA, 48 samples were not. In order to find out the specificity and sensitivity of the method, the known bacteria were determined by real-time fluorescence quantitation PCR. In order to detect the carrying condition of nosocomial MRSA, the nasal swabs of 88 clinical medical staff and patients were determined by real-time fluorescence quantitation PCR.

Results

All of the cultured MRSA determined by real-time fluorescence quantitation PCR were MRSA, and the sensitivity was 100%. All of the cultured non-MRSA determined by real-time fluorescence quantitation PCR were not MRSA either, and the specificity was 100%. The sensitivity of determining MRSA by real-time fluorescence quantitation PCR can be confirmed as 1×103 cfu/mL. Among 48 nasal swabs of patients, 26 samples weremecA gene positive, 28 samples wereStaphylococcusaureus positive, 20 samples were both positive simultaneously (which were MRSA), and the positive rate of MRSA was 41.6%. Among 40 nasal swabs of clinical medical staff, 12 samples weremecA gene positive, 13 samples wereStaphylococcusaureus positive, 9 samples were both positive simultaneously (which were MRSA), and the positive rate of MRSA was 22.5%.

Conclusions

Real-time fluorescence quantitation PCR can be used for the rapid determination of MRSA.

Keyword: Real-time fluorescence quantitation polymerase chain reaction; Methicillin-resistantStaphylococcus aureus; Rapid determination
引言

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)于1961年首次在英国发现[ 1],到上世纪80年代其感染几乎遍及全球,并且感染率逐年升高[ 2]。中国属于MRSA感染严重的国家之一。2006至2007年全国平均检出率为56.10%[ 3],而2009至2011年的数据显示,其检出率又有所增加,多数地区达60%以上[ 4, 5, 6]。MRSA的感染具有地区特异性,部分大型综合性医院的感染率甚至达到金黄色葡萄球菌感染总数的90%以上。

我们采用实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)对临床分离的已知细菌进行检测,探讨实时荧光定量PCR应用于临床MRSA检测的特异性和敏感性;对患者及医护人员的鼻拭子样本进行检测,了解MRSA感染的流行病学情况,对MRSA的院内感染进行实时预防和监控。

材料和方法
一、材料

1.菌株

2012年1至3月上海曙光医院70例经过微生物分离培养方法鉴定的样本,其中22例为MRSA,48例为非MRSA的其他细菌。2012年1至3月曙光医院患者及医护人员鼻拭子样本88例(患者样本48例,医护人员样本40例),从同一患者同一部位多次分离的相同菌株按1次统计。以标准菌株金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)作为质控菌株。

2.试剂

上海之江生物科技有限公司生产的MRSA核酸测定试剂盒(荧光定量PCR);法国梅里埃公司生产的革兰阳性细菌鉴定卡(GP);上海伊华公司生产的血琼脂平板。

3.仪器

美国应用生物系统公司PCR扩增仪(ABI7500);法国梅里埃公司细菌鉴定及药物敏感性分析仪(VITEK2-COMPACT)。

二、方法

1.细菌鉴定

样本送实验室后及时接种于血琼脂培养基上,经35 ℃培养24 h,革兰阳性球菌用GP板条进行鉴定,金黄色葡萄球菌用凝固酶试验进行确认。

2.药物敏感性试验

按2012年美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standard Institute,CLSI)标准操作[ 7],将0.5麦氏单位金黄色葡萄球菌的新鲜菌悬液均匀涂布于水解酪蛋白琼脂(mueller-hinton,MH)平板,贴上头孢西丁(30 μg)纸片, 35 ℃有氧环境孵育24 h,观察结果并测量抑菌圈直径。金黄色葡萄球菌:抑菌圈直径≤21 mm为耐药(MRSA),≥22 mm为敏感,即为甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(methicillin-sensitive Staphylococcus aureus,MSSA)。

3.实时荧光定量PCR快速检测MRSA

患者及医护人员鼻拭子样本根据MRSA耐药基因检测试剂盒操作说明书进行操作。反应体系为20 μL,其中检测混合液17.6 μL,酶0.4 μL,模板2 μL。扩增条件37 ℃ 2 min、94 ℃ 2 min,循环1次;93 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,循环40次。每份样本包括2管,1管用于检测金黄色葡萄球菌特异性核酸片段,1管用于检测mecA耐药基因。待检样本“crossing point”栏显示≤35,检测结果报告为阳性。金黄色葡萄球菌核酸荧光检测与 mecA核酸荧光检测同为阳性的报告MRSA。

4. 实时荧光定量PCR敏感性测定

将浓度为1×106 cfu/mL的样本进行梯度稀释,得到1×105、1×104、1×103、1×102和1×101 cfu /mL共5个浓度的样本。对1×104、1×103、1×102和1×101 cfu/mL这4个浓度的样本各检测10次。统计各浓度样本的阳性率,阳性率达到100%的最低浓度样本即为本方法的检测下限。

结果
一、经培养鉴定的70例已知细菌实时荧光定量PCR检测

22例MRSA样本,实时荧光定量PCR检测结果均为MRSA,敏感性为100%;48例非MRSA样本,实时荧光定量PCR检测结果均为非MRSA,特异性为100%。见表1:

表1 实时荧光定量PCR与细菌鉴定仪法检测结果比较[株数(%)]
二、实时荧光定量PCR敏感性测定

样本浓度为≥1×103cfu/mL时,金黄色葡萄球菌和 mecA的阳性检出率均为100%;样本浓度为1×102cfu/mL时,金黄色葡萄球菌阳性检出率为80%, mecA的阳性检出率为70%;样本浓度为1×101cfu/mL时,金黄色葡萄球菌和 mecA的阳性检出率均为20%。实时荧光定量PCR检测MRSA的敏感性可确定为1×103cfu/mL,见图1、图2。与试剂盒标注的敏感性一致。

图1 实时荧光定量PCR检测 mecA耐药基因的敏感性

图2 实时荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌核酸的敏感性

三、88例来自患者和医护人员的鼻拭子样本的MRSA荧光定量PCR检测

48例患者鼻拭子样本中 mecA耐药基因阳性26例,金黄色葡萄球菌阳性28例,两者同时阳性(即为MRSA)20例,MRSA阳性检出率为41.6%;40例医护人员鼻拭子样本中 mecA耐药基因阳性12例,金黄色葡萄球菌阳性13例,两者同时阳性(即为MRSA)9例,MRSA阳性检出率为22.5%。见表2。阳性样本实时荧光定量PCR结果见图3、图4:

表2 患者和医护人员鼻拭子样本MRSA荧光定量PCR检测结果

图3 实时荧光定量PCR检测鼻拭子标本 mecA耐药基因阳性图

图4 实时荧光定量PCR检测鼻拭子样本金黄色葡萄球菌核酸阳性图

讨论

MRSA具有传播途径广、致病性强的特点,加上抗菌药物的长期和不合理使用,MRSA的耐药种类日益增加,耐药程度日益严重,给临床治疗带来巨大的困难。MRSA往往同时对大环内酯类、四环素类、喹喏酮耐药,即表现为多重耐药。对万古霉素耐药的金黄色葡萄球菌(vancomycin-resistant Staphylococcus aureus,VRSA)也已出现。如不提高警惕,有效控制相关抗菌药物的使用,VRSA的扩散传播可能也只是时间问题。控制MRSA院内感染除了控制传染源和积极的治疗措施之外,切断MRSA的传播途径非常重要,减少MRSA的物表定植和加强医护人员手部卫生等措施是主要的控制方式。而有效预防和控制MRSA感染的关键是及时、准确地检测出MRSA,为临床合理使用抗生素和预防院内感染的爆发流行提供参考依据。

MRSA现有的检测方法主要包括表型检测、免疫学检测和基因检测[ 8, 9]。国内大部分医疗机构目前多采用细菌培养联合药物敏感性试验法。该法操作简便,成本低廉,特异性较高,但所需时间较长,培养阳性率低。直接检测金黄色葡萄球菌中的耐药基因 mecA的荧光定量PCR正受到越来越多的青睐。实时荧光定量PCR与常规PCR相比,具有敏感性高、特异性强、污染少、自动化程度高等特点[ 10],其反应实时监控,且可以对靶位基因进行定量检测,对临床样本的检测时间甚至可缩短至1 h[ 11]。近年来的文献报道显示,实时荧光定量PCR技术是目前最准确、重现性最好并得到国际公认的核酸分子定量定性检测的标准方法。实时荧光定量PCR检测MRSA不仅能实现MRSA的快速检测,更可为指导临床用药提供有价值的参考[ 12]。

MRSA院内感染的传染源主要为患者、医务人员带菌者及细菌储存所(环境)。除了患者之间的传播,MRSA的另一个传播途径就是通过医护人员的工作服、手和鼻前庭来传播,前两者都会与患者接触并直接传播MRSA,而鼻前庭携带则是在长期的诊疗过程中定植,最终可能发生感染,也可称为院内外传播MRSA的传染源。

本研究通过采用实时荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌特异性基因和MRSA特异性耐药基因 mecA来确定是否为MRSA感染。结果显示,22例培养法为MRSA,荧光定量PCR检测结果均为MRSA;48例培养法为非MRSA,荧光定量PCR检测结果均为非MRSA,两种方法结果完全一致。说明实时荧光定量PCR的准确度和敏感性都不逊于培养法,且该方法对临床样本的检测时间较培养法要快速。检测下限达到1×103cfu/mL,与试剂盒标注的敏感性一致。

88例用于流行病学分析的临床样本中患者鼻拭子样本48例,其中 mecA耐药基因阳性26例,金黄色葡萄球菌基因阳性28例,两者同时阳性(即为MRSA)20例,MRSA阳性检出率为41.6%;医护人员鼻拭子样本40例,其中 mecA 耐药基因阳性12例,金黄色葡萄球菌基因阳性13例,两者同时阳性(即为MRSA)9例,MRSA阳性检出率为22.5%。由此可见,医护人员MRSA 携带已经成为医院感染的危险因素,医护人员可能被MRSA 感染患者污染,也可能被MRSA 污染的环境污染,再通过接触传播给其他患者,引起同期病房内流行。患者MRSA 的检出明显高于医护人员,患者之间通过接触同样存在交叉感染的危险。已经明确MRSA的医院感染主要经接触传播,医护人员及患者的手和鼻咽是重要的传播中介。加强洗手和隔离等卫生预防学措施可以有效地降低MRSA的感染率。用糖肽类抗菌药物不能预防MRSA的感染,也不能消除MRSA 的长期定植。已有研究表明鼻腔涂抹2%莫匹罗星(百多邦,Mupirocin) 连续5 d可以有效消除MRSA 的鼻腔定植[ 13, 14] 。

综上所述,应用实时荧光定量PCR方法快速检测MRSA可以及时掌握MRSA感染情况,采取有效的预防、消毒和隔离措施,对医院内MRSA的感染和控制具有重要意义。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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