引用本文
朱立岳, 关明, 康志华, 高建萍, 翁丽贞, 章励, 胡雷光. 血清TFPI-2基因甲基化在胃癌诊断中的临床价值 . 检验医学,2014, 29(7): 712-717[ZHU Liyue, GUAN Ming, KANG Zhihua, GAO Jianping, WENG Lizhen, ZHANG Li, HU Leiguang. Clinical significance on the detection of serum methylated tissue factor pathway inhibitor 2 gene in the diagnosis of gastric cancer. Labratory Medicine, 2014, 29(7): 712-717]  
Permissions
Copyright©2014, 《检验医学》编辑部
《检验医学》编辑部版权所有
血清TFPI-2基因甲基化在胃癌诊断中的临床价值
朱立岳1, 关明2, 康志华2, 高建萍3, 翁丽贞1, 章励1, 胡雷光1
1.上海市静安区中心医院/复旦大学华山医院静安分院检验科,上海 200040
2.复旦大学附属华山医院检验医学科,上海 200040
3.上海市静安区中心医院/复旦大学华山医院静安分院消化科,上海 200040
摘要
目的

通过测定组织及血清组织因子途径抑制物2(TFPI-2)基因甲基化,探讨其作为一种肿瘤标志物对胃癌诊断的临床价值。

方法

收集32例胃癌、29例萎缩性胃炎作为研究对象,以30例不排除浅表性胃炎的正常对象作为对照。应用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)方法,测定组织及血清TFPI-2基因甲基化状态。应用电化学发光免疫法测定癌胚抗原(CEA)、糖类抗原199(CA199)。

结果

组织TFPI-2基因甲基化检出率胃癌组为53.13%、萎缩性胃炎组为37.93%、对照组为3.33%。胃癌组明显高于对照组(P<0.05)。血清TFPI-2基因甲基化检出率胃癌组为28.13%,萎缩性胃炎组为6.90%,对照组未检出。胃癌组明显高于萎缩性胃炎组(P<0.05)和对照组(P<0.05)。血清TFPI-2基因甲基化检测灵敏度为28.13%,特异性为96.61%。血清检出阳性占组织检出阳性的比率为37.93%。胃癌组血清TFPI-2基因甲基化与性别、年龄、Borrmann's 分期、CEA和CA199检测结果无关(P>0.05)。胃癌组血清TFPI-2基因甲基化与CEA、CA199阳性检出率分别为28.13%、21.88%、18.75%。联合3项阳性检出率为53.13%,显著高于3项各自单独检测(P<0.05)。

结论

血清TFPI-2基因甲基化来源于组织,其对胃癌诊断特异性较高,但灵敏度较差。联合检测血清CEA、CA199有利于提高其灵敏度。血清TFPI-2基因甲基化测定对胃癌的诊断有一定价值。

关键词: 组织因子途径抑制物-2基因; 甲基化; 血清游离DNA; 胃癌
中图分类号:R446.11 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2014)07-0712-06
Clinical significance on the detection of serum methylated tissue factor pathway inhibitor 2 gene in the diagnosis of gastric cancer
ZHU Liyue1, GUAN Ming2, KANG Zhihua2, GAO Jianping3, WENG Lizhen1, ZHANG Li1, HU Leiguang1
1.Department of Clinical Laboratory, Shanghai Jing' an District Central Hospital/Jing' an Branch of Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, China
2. Department of Laboratory Medicine, Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, China
3.Department of Digestion, Shanghai Jing' an District Central Hospital/Jing' an Branch of Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, China
Abstract
Objective

Through the detection of serum and tissue methylated tissue factor pathway inhibitor 2 (TFPI-2) gene, to investigate its clinical significance as a tumor marker for the diagnosis of gastric cancer.

Methods

A total of 32 gastric cancer patients and 29 atrophic gastritis patients were enrolled, and 32 healthy subjects including superficial gastritis were enrolled as control group. MethylatedTFPI-2 gene was detected by methylation-specific polymerase chain reaction (MSP). Carcinoembryonic antigen (CEA) and carbohydrate antigen 199 (CA199) were determined by electrochemiluminescence immunoassay.

Results

The positive rates of methylatedTFPI-2 gene in tissue were 53.13% in gastric cancer group, 37.93% in atrophic gastritis group and 3.33% in control group. Tissue methylatedTFPI-2 gene was significantly higher in gastric cancer group than in control group (P<0.05). The positive rates of methylatedTFPI-2 gene in serum were 28.13% in gastric cancer group, 6.90% in atrophic gastritis group, but none in control group. Serum methylatedTFPI-2 gene was significantly higher in gastric cancer group than in atrophic gastritis group (P<0.05) and in control group (P<0.05). The sensitivity and specificity of serum methylatedTFPI-2 gene for the diagnosis of gastric cancer were 28.13% and 96.61%. The 37.93% positive rate was got in serum against tissue. TheTFPI-2 gene methylation in serum showed no correlation with sex, age, Borrmann' s classification, CEA and CA199 in gastric cancer group (P>0.05). In gastric cancer group, the positive rates of methylatedTFPI-2 gene, CEA and CA199 were 28.13%, 21.88% and 18.75%, respectively. If performing the combined determination of all the 3 parameters, the positive rate was 53.13%, and the positive rate was significantly higher than those of the single determinations (P<0.05).

Conclusions

TheTFPI-2 gene methylation in serum derives from gastric cancer tissues, and it shows high specificity for the diagnosis of gastric cancer, but the sensitivity is relatively low. It can improve the sensitivity if performing the combined determination with CEA and CA199. The detection of serumTFPI-2 gene methylation has certain significance for diagnosing gastric cancer.

Keyword: Tissue factor pathway inhibitor 2 gene; Methylation; Serum free DNA; Gastric cancer
引言

组织因子途径抑制物2(tissue factor pathway inhibitor 2,TFPI-2)是一种属于丝氨酸蛋白酶抑制物超家族成员的蛋白酶抑制剂,可以抑制细胞外基质的降解。Monk等[ 1]首先报道了 TFPI-2基因启动子甲基化导致基因沉默的现象。随后相继有文献[ 4, 5, 6]证实胃癌组织普遍存在 TFPI-2基因启动子过度甲基化现象,而癌旁组织和正常组织则未发现该基因甲基化,推测 TFPI-2基因甲基化是一种新的胃癌分子标志物。肿瘤患者的外周血中常存在来源于原发病灶的特异性DNA,检测外周血中游离的特异性DNA给肿瘤的早期诊断和病情监测提供了新的手段。近期有文献相继报道了在肿瘤患者血清中检出到循环DNA的异常甲基化,有望成为一种新的分子肿瘤标志物[ 2, 3]。我们通过测定组织及血清游离DNA中 TFPI-2基因甲基化状态,分析其作为一种肿瘤标志物对胃癌诊断的临床价值。

材料和方法
一、 样本收集与处理

来源于20112013年在上海市静安区中心医院进行胃镜检查的患者,所有研究对象未经放化疗,且排除其它部位肿瘤,摘取组织均经病理确诊。其中胃癌组32例(男18例,女14例),年龄3775岁;萎缩性胃炎组29例(男13例,女16例),年龄3477岁。另取不排除浅表性胃炎的正常对象30例(男15例,女15例)作为对照组,年龄3373岁。所有生物材料及测定结果的使用均获得研究对象书面的知情同意。组织标本通过胃镜检查获得,经生理盐水清洗后,-70℃保存待用。同时采集血液4 mL,自然凝固后以1 000× g离心5 min,分离血清,转移到冻存管中-70℃保存。

二、 方法

1. DNA模板制备

取30 mg胃组织,按组织基因组DNA提取试剂盒(天根生物科技有限公司)的操作方法提取和获得组织DNA。取400 μL血清,按微量样品基因组DNA提取试剂盒(天根生物科技有限公司)的操作方法提取和获得血清游离DNA。取得的DNA溶解于去离子双蒸馏水,置-20 ℃保存备用。DNA使用前经紫外分光光度法测定其浓度,取500 ng DNA选用EZ DNA Methylation-Gold Kit(ZYMO RESEARCH 美国),按试剂盒提供的说明书进行亚硫酸氢盐修饰和纯化。获得的修饰后DNA用15μL去离子双蒸馏水溶解,置-20℃保存备用。

2.甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)

参照文献[ 7]由上海生工生物工程技术服务有限公司合成甲基化和非MSP引物。甲基化引物序列为5' -CGG CGG GGT GAT AGT TTT C-3' (上游引物)和5' -CAA ACG ACC CGA ATA CCC GCT TTA TAC G-3' (下游引物),扩增产物片段大小为106 bp。非甲基化引物序列为5' -GTG GTG GGG TGA TAG TTT TTG-3' (上游引物)和5'-CCA AAC AAC CCA AAT ACC CAC TTT ATA CA-3' (下游引物),扩增产物片段大小为109 bp。取上述步骤获得的修饰后的DNA 2 μL进行PCR扩增,PCR反应体系由预混合的TaKaRa Taq Hot Start Version试剂盒提供,其中分别加入10 nmol/L甲基化正反向引物,总反应体积20 μL。同时再取修饰后的DNA 2 μL,同样的反应体系,加入10 nmol/L非甲基化正反向引物。反应条件均为94℃预变性5 min;随后扩增40个循环:温度及时间为94℃ 30 s,57℃ 30 s,72℃ 30 s;最后72℃延伸5 min。甲基化酶SssI 修饰的和未被修饰的正常胃组织作为阳性和阴性对照,用无菌双蒸水作为空白对照。最后取5 μL聚合酶链反应(PCR)产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,用凝胶成像系统分析结果,电泳结果的判断详见图1。以甲基化特异性引物扩增出目的条带作为 TFPI-2基因启动子甲基化阳性的标志,将仅非甲基化特异性引物扩增出条带作为 TFPI-2基因启动子甲基化阴性的标志。每批检测随机选取阴性和阳性各12例,委托北京六合华大基因科技股份有限公司测序,以验证MSP结果,测序结果见图2:

图1 TFPI-2基因MSP产物琼脂糖凝胶电泳结果判断

注:U表示使用非甲基化引物;M表示使用甲基化引物;S16、S10为甲基化阴性;S6、S3、S1为甲基化阳性;Negtive为阴性对照;Positive为阳性对照

图2 TFPI-2基因MSP产物测序结果

3.糖类抗原199(CA199)、癌胚抗原(CEA)测定

使用罗氏Cobas e 411电化学发光免疫分析仪测定CA199、CEA血清浓度,试剂为罗氏配套试剂。CA199>37 U/mL,CEA>5 ng/mL判断为阳性。

三、统计学方法

采用SAS 8.02软件进行统计分析。计数资料采用卡方检验进行分析。 P<0.05为差异有统计学意义。

结果
一、 各组 TFPI-2基因甲基化检出情况

32例胃癌组织中 TFPI-2基因甲基化阳性检出率为53.13%(17例),血清中的检出率为28.13%(9例)。29例萎缩性胃炎组织中 TFPI-2基因甲基化阳性检出率为37.93%(11例),血清中的检出率为6.90%(2例)。30例正常对照组织中 TFPI-2基因甲基化阳性检出率3.33%(1例),血清中未检出 TFPI-2基因甲基化。从研究对象的组织中共检出29例 TFPI-2基因甲基化阳性,这些对象的血清中检出11例阳性,血清检出阳性占组织检出阳性的比率为37.93%。组织检测阴性,血清也均呈阴性。血清中检出的 TFPI-2基因甲基化状态与组织中一致性尚可, Kappa值为0.454 4(χ2=26.750 9, P<0.05)。

胃癌组组织中 TFPI-2基因甲基化检出率与萎缩性胃炎组比较差异无统计学意义( P>0.05),但明显高于正常对照组( P<0.05)。胃癌组血清中 TFPI-2基因甲基化检出率明显高于萎缩性胃炎组( P<0.05)和正常对照组( P<0.05)。血清 TFPI-2基因甲基化检测诊断胃癌的灵敏度为28.13%,特异性为96.61%。见表1:

表1 组织、血清 TFPI-2甲基化的情况比较
二、血清 TFPI-2基因甲基化与其它临床资料的关系

胃癌组不同性别、年龄、Borrmann' s 分期血清 TFPI-2基因甲基化检出率并无明显差异( P>0.05)。与CEA和CA199检测结果缺乏一致性( Kappa=0.171 0, P>0.05; Kappa=0.053 8, P>0.05)。见表2:

表2 胃癌患者血清 TFPI-2基因甲基化与其它临床资料的关系
三、血清 TFPI-2基因甲基化与其它血清肿瘤标志物联合检测的结果

血清 TFPI-2基因甲基化与CEA、CA199在32例胃癌组的阳性检出率并无明显区别( P>0.05),分别为28.13%、21.88%、18.75%。联合3项阳性检出率为53.13%,显著高于3项各自单独检测( P<0.05)。见表3:

表3 胃癌组血清 TFPI-2基因甲基化、CEA、CA199单独与联合检测阳性率比较
讨论

研究发现抑癌基因的异常甲基化导致抑癌基因沉默或失活,是造成肿瘤抑制丧失的重要原因,与胃癌的发生发展有密切的关系[ 8]。 TFPI-2基因位于人染色体7q22, 其编码蛋白称为组织因子途径抑制物2(TFPI-2),也称胎盘蛋白-5。TFPI-2是一种丝氨酸蛋白酶抑制物, 能抑制肿瘤细胞分泌的多种丝氨酸蛋白酶,从而抑制细胞外基质的降解,具有抗肿瘤和抑制肿瘤侵袭转移等生物学功能。 TFPI-2基因的甲基化发生在位于基因启动子CpG岛,是抑癌基因 TFPI-2基因表达降低或失活的重要原因,与肿瘤细胞的发展和迁徙有密切的相关性[ 9, 10, 11]。

本研究结果发现胃癌组织中 TFPI-2甲基化的发生较为普遍,显著高于正常胃组织中的发生率。国外相关研究报道在胃癌组织中的阳性率为80%和83%[ 4, 6],高于本研究的阳性率。可能同本研究胃癌组患者取自胃镜检查病例,多为早期癌症有关。也有Takada H等[ 5]从38例早期胃癌组织中仅检出了7例阳性。但本研究在萎缩性胃炎病例的组织中也发现了37.93%的检出率,其中3例病理诊断有不典型增生的组织中有2例检出了 TFPI-2基因甲基化。萎缩性胃炎被认为是一种癌前病变,甲基化作为一种基因改变,要早于病理变化,这可能是这几例萎缩性胃炎中查出 TFPI-2甲基化原因。通过本研究证实了 TFPI-2基因甲基化的发生从正常、萎缩性胃炎、胃癌的发展逐渐增加,是在胃组织发生癌变前的早期事件。

近来的研究认为,血清中游离的DNA来源之一就是肿瘤细胞释放,肿瘤患者的血清中也能检测到DNA的异常甲基化[ 12]。本研究所有在血清中检出 TFPI-2基因甲基化的研究对象在其相应的组织中同时也有检出。说明血清中 TFPI-2基因甲基化阳性与组织中一致,也验证了血清中游离DNA异常甲基化来源于组织细胞。但只从37.93%的组织阳性对象的血清中检出阳性。这种组织和血清的 TFPI-2基因甲基化阳性检出比例的不一致性可能与组织释放到血循环中的DNA量较少有关。微量DNA的检出受到MSP检测灵敏度的限制。

胡影等[ 13]总结了循环中游离的肿瘤细胞来源有两种途径:(1)由坏死或凋亡的肿瘤细胞释放;(2)由循环血液中完整的肿瘤细胞发生溶胞后释放。本实验发现胃癌组血清中的检出率明显高于正常对照与萎缩性胃炎,而且萎缩性胃炎组中2例检出 TFPI-2基因甲基化阳性中1例病理诊断有不典型增生的癌前病变的特征。比较结果显示血清和胃组织中的 TFPI-2基因甲基化检出情况不同,前者萎缩性胃炎组的检出率很低。推测这种现象可能与肿瘤细胞的凋亡速度比较快及肿瘤细胞随血液转移进入血循环的增加有关,故释放到循环血液中的DNA量较多。孙正阳等[ 14]也认为 TFPI-2是多种蛋白酶的抑制物,参与了维持细胞外介质完整的调控。 TFPI-2基因甲基化导致的表达下降,也是导致其被释放到血液中的主要原因。所以血清中的 TFPI-2基因甲基化检测相对于组织而言对胃癌的诊断更具意义。本研究结果显示,血清 TFPI-2基因甲基化检测对胃癌诊断的阳性率为28.13%,但特异性达到96.61%,对排除胃癌诊断有一定的临床参考价值。相关研究[ 15]也报道了胃癌及其癌前病变存在多个基因的变化,单个基因的改变只存在于一部分肿瘤中,与本研究结果的较低阳性率相符。通过与其它肿瘤标志物CEA和CA199相比较,血清 TFPI-2基因与其检测结果并无相关性,如果联合上述2项一起检测阳性率可提高至53.13%。如果联合检测其他胃癌相关遗传学标志物可能也会提高阳性率。

陆俊骏等[ 15]回顾了以往的研究认为晚期肿瘤释放到循环血液中的DNA更多,且与肿瘤转移相关。孙正阳等[ 14]也认为 TFPI-2通过抑制蛋白酶活性抑制了肿瘤的转移,其表达下降是肿瘤转移的主要原因之一。Nigro 等[ 15]在近期的研究中也发现晚期黑色素瘤的血清 TFPI-2基因甲基化的检出率较高。但本研究对按Borrmann' s分期进行分组比较的结果并不符合上述结果,ⅢⅣ期血清中的检出率略高于ⅠⅡ期,分别为33.33%和21.42%。虽然晚期肿瘤血清中DNA的阳性结果比例有提高的趋势,但差异无统计学意义,这或许与样本数较少有关。

综上所述, TFPI-2基因甲基化与胃癌的发生发展密切相关,且可由组织释放到循环血液中并被测得。血清 TFPI-2基因甲基化对胃癌的诊断有一定价值,为胃癌的诊断及疗效检测提供了一种新的手段。其对胃癌诊断的准确评估及临床实际应用仍需加大样本做进一步的研究。联合其它肿瘤标志物检测可提高其敏感度,而肿瘤相关基因标志物的联合检测将会引起众多学者的广泛兴趣。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] Zou HZ, Yu BM, Wang ZW, et al. Detection of aberrant p16 methylation in the serum of colorectal cancer patients[J]. Clin Cancer Res, 2002, 8(1): 188-191. [本文引用:1] [JCR: 2.914]
[2] Monk D, Wagschal A, Arnaud P, et al. Comparative analysis of human chromosome 7q21 and mouse proximal chromosome 6 reveals a placental-specific imprinted gene, TFPI2/Tfpi2, which requires EHMT2 and EED for allelic-silencing[J]. Genome Res, 2008, 18(8): 1270-1281. [本文引用:1] [JCR: 14.397]
[3] Khan S, Coulson JM, Woll PJ. Genetic abnormalities in plasma DNA of patients with lung cancer and other respiratory diseases[J]. Int J Cancer, 2004, 110(6): 891-895. [本文引用:1] [JCR: 1.941]
[4] Jee CD, Kim MA, Jung EJ, et al. Identification of genes epigenetically silenced by CpG methylation in human gastric carcinoma[J]. Eur J Cancer, 2009, 45(7): 1282-1293. [本文引用:2] [JCR: 5.061]
[5] Takada H, Wakabayashi N, Dohi O, et al. Tissue factor pathway inhibitor 2 (TFPI2) is frequently silenced by aberrant promoter hypermethylation in gastric cancer[J]. Cancer Genet Cytogenet, 2010, 197(1): 16-24. [本文引用:2] [JCR: 1.929]
[6] Hibi K, Goto T, Kitamura YH, et al. Methylation of the TFPI2 gene is frequently detected in advanced gastric carcinoma[J]. Anticancer Res, 2010, 30(10): 4131-4133. [本文引用:2] [JCR: 1.713]
[7] Glöckner SC, Dhir M, Yi J M, et al. Methylation of TFPI2 in stool DNA: a potential novel biomarker for the detection of colorectal cancer[J]. Cancer Res, 2009, 69(11): 4691-4699. [本文引用:1] [JCR: 8.65]
[8] Qu Y, Dang S, Hou P. Gene methylation in gastric cancer[J]. Clin Chim Acta, 2013, 424: 53-65. [本文引用:1] [JCR: 2.85]
[9] Kong D, Ma D, Bai H, et al. Expression and characterization of the first kunitz domain of human tissue factor pathway inhibitor-2[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2004, 324(4): 1179-1185. [本文引用:1] [JCR: 2.406]
[10] Takada H, Wakabayashi N, Dohi O, et al. Tissue factor pathway inhibitor 2 (TFPI2) is frequently silenced by aberrant promoter hypermethylation in gastric cancer[J]. Cancer Genet Cytogenet, 2010, 197(1): 16-24. [本文引用:1] [JCR: 1.929]
[11] 冷 雪, 孙保存, 臧凤琳, 等. 胃癌中组织因子途径抑制剂2的表达及其与预后和肿瘤血管生成模式的相关性研究[J]. 中国肿瘤临床, 2012, 39(8): 433-438. [本文引用:1]
[12] 马晓杰, 李景鹏, 赵 勇. 血浆中游离核酸: 分子诊断的新靶点[J]. 生命的化学, 2006, 26(2): 147-149. [本文引用:1]
[13] 胡 影, 倪 虹. 人体游离循环 DNA 的研究进展[J]. 遗传, 2008, 30(7): 815-820. [本文引用:1]
[14] 孙振阳, 汤志刚. TFPI-2基因与消化道肿瘤关系的研究进展[J]. 中华肿瘤防治杂志, 2008, 15(3): 227-230. [本文引用:2]
[15] 陆俊骏, 钱 烨, 连 强. 胃癌遗传学及表遗传学研究进展[J]. 中国医药导报, 2013, 10(19): 43-46. [本文引用:3]
[16] Lo Nigro C, Wang H, McHugh A, et al. Methylated tissue factor pathway inhibitor 2 (TFPI2) DNA in serum is a biomarker of metastatic melanoma[J]. J Invest Dermatol, 2013, 133(5): 1278-1285. [本文引用:1] [JCR: 6.193]