引用本文
郭建, 范齐文, 范小勇, 马辉, 钱雪琴, 胡香南, 吴文娟. 结核分枝杆菌rdESAT-6抗原在耻垢分枝杆菌中的制备及其血清学诊断研究. 检验医学2014, 29(6):607-612
GUO Jian, FAN Qiwen, FAN Xiaoyong, MA Hui, QIAN Xueqin, HU Xiangnan, WU Wenjuan. Preparation and serology diagnosis research of recombinant Mycobacterium smegmatis expressing rdESAT-6 of Mycobacterium tuberculosis. Labratory Medicine, 2014, 29(6):607-612  
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结核分枝杆菌rdESAT-6抗原在耻垢分枝杆菌中的制备及其血清学诊断研究
郭建1, 范齐文2, 范小勇1, 马辉1, 钱雪琴1, 胡香南1, 吴文娟2
1. 上海市(复旦大学附属)公共卫生临床中心医学检验科,上海 201508
2. 上海市东方医院南院医学检验科,上海 200123

通讯作者:吴文娟,联系电话:021-20334503。

作者简介:郭 建,男,1983年生,硕士,技师,主要从事病原微生物快速诊断及耐药性研究。

基金:上海市卫生局青年课题资助项目(2010Y018); 国家自然科学基金(81201340);
摘要
目的

构建结核分枝杆菌(MTB)融合基因2×esat-6原核表达载体,利用耻垢分枝杆菌诱导表达、纯化早期分泌抗原ESAT-6重组二聚体(rdESAT-6),Western blot分析其抗原性,并评估其在结核病患者中的血清学诊断价值。

方法

以DNA疫苗HG856A2为模板扩增2×esat-6基因,构建pMF41-2×esat-6原核表达载体,电转化耻垢分枝杆菌,诱导表达rdESAT-6蛋白,Western blot分析其抗原性。收集126例确诊的结核病患者和42名健康体检者的血清,用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)和结核斑点金免疫渗滤试验(TB-DOT)检测血清结核抗体,评估rdESAT-6在结核血清学诊断中的价值。

结果

成功构建了pMF41-2×esat-6重组质粒,以包涵体形式表达了rdESAT-6蛋白,纯化的蛋白纯度在95%以上,可与小鼠抗ESAT-6血清发生特异性反应。126例结核病患者血清检测结果表明,rdESAT-6蛋白在MTB阳性组和阴性组患者血清学诊断的敏感性分别为79.75% (63/79)、61.70% (29/47),好于TB-DOT的62.03% (49/79)、44.68% (21/47)(P<0.05)。2种方法对42名健康体检者血清诊断特异性均为95.24% (40/42)。

结论

MTB的融合蛋白rdESAT-6用于结核病血清学检测具有较好的敏感性和特异性,可作为结核病血清学诊断的优选抗原。

关键词: 结核分枝杆菌; ESAT-6; rdESAT-6; 融合蛋白; 免疫学诊断
中图分类号:R446.5 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2014)06-0607-06
Preparation and serology diagnosis research of recombinant Mycobacterium smegmatis expressing rdESAT-6 of Mycobacterium tuberculosis
GUO Jian1, FAN Qiwen2, FAN Xiaoyong1, MA Hui1, QIAN Xueqin1, HU Xiangnan1, WU Wenjuan2
1. Department of Clinical Laboratory, Shanghai Public Health Clinical Center, Fudan University, Shanghai 201508, China
2. Department of Clinical Laboratory, South Branch, East Hospital, Shanghai 200123, China
Fund:
Abstract
Objective

To construct the prokaryotic expression vectors containingMycobacterium tuberculosis(MTB) fusion gene. Meanwhile, the inducible expression of fusion protein recombinant dimer ESAT-6 (rdESAT-6) was performed in the expression systems ofMycobacterium smegmatis. The fusion protein was purified, and the antigenic specificities of fusion protein was analyzed by Western blot. The significance of fusion proteins for the diagnosis of tuberculosis was evaluated.

Methods

The 2×esat-6 gene was amplified with DNA vaccine HG856A2. The 2×esat-6 gene was then cloned into plasmid pMF41 for the construction of prokaryotic expression vector pMF41-2×esat-6. The recombinant plasmid pMF41-2×esat-6 was electroporated intoMycobacterium smegmatis. The target gene was induced to express fusion protein rdESAT-6. The antigenic specificities of purified fusion protein was analyzed by Western blot with mouse antiserum against rdESAT-6. The sensitivity and specificity of these fusion proteins for the diagnosis of tuberculosis were assayed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and tuberculosis dot immunogold filtration assay (TB-DOT) test kit for 126 tuberculosis patients and 42 healthy controls.

Results

The prokaryotic expression vector pMF41-2×esat-6 was constructed successfully, and the related fusion protein was expressed in the form of inclusion body. The fusion protein was purified, and the purity of these proteins were great than 95%. The fusion protein was antigenic with ESAT-6 mouse antiserum. The sensitivities of the 126 tuberculosis patients and negative cases of serological diagnosis were 79.75% (63/79) and 61.70% (29/47), respectively, which were better than those of TB-DOT test kit [62.03% (49/79) and 44.68% (21/47),P<0.05]. The specificity was both 95.24% (40/42).

Conclusions

The fusion proteins of MTB are successfully prepared in this study with good sensitivity and specificity, which can be used for the diagnosis of tuberculosis.

Keyword: Mycobacterium tuberculosis; ESAT-6; Recombinant dimer ESAT-6; Fusion protein; Immunology diagnosis

据世界卫生组织报告,2011年新发结核病病例约870 万,其中约113万人合并感染人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV);死于结核病感染的140万人中,约43万为HIV阳性[ 1]。对结核病及时、准确的诊断和治疗,已经成为预防和控制结核病的重要环节。ESAT-6 (6kD early secretory antigenic target),即相对分子质量为6 000的早期分泌性抗原靶分子,是RD1区的一种具有较强细胞免疫活性的低相对分子质量分泌性蛋白。Sørensen等[ 2]发现ESAT-6有2个等电点,分别为4.0和4.5,这可能与蛋白质的修饰有关,在自然状态下ESAT-6可能以多聚体形式存在。有学者在乳酸链球菌中首次表达了结核分枝杆菌( Mycobacterium tuberculosis,MTB)EAST-6 重组二聚体(recombinant dimmer EAST-6,rdESAT-6),在对其药效学和安全性进行了较为系统的研究之后,将其在人体上进行了皮试试验,结果表明皮内注射rdESAT-6 具有一定的安全性,其特异性明显优于结核菌素纯蛋白衍生物(tuberculin purified protein derivative,PPD)[ 3, 4, 5]。

耻垢分枝杆菌( Mycobacterium smegmatis)是一种非致病性的、比卡介苗( Bacillus calmette-guérin, BCG)生长快、转化率高的分枝杆菌突变株,可使外源基因在其细胞内得到表达[ 6]。有研究表明,从耻垢分枝杆菌中表达纯化的抗原,具有天然构象的糖基化位点等蛋白修饰,较大肠埃希菌表达系统制备的蛋白具有更高的免疫原性[ 7, 8]。本研究首次在耻垢分枝杆菌中表达了rdESAT-6,并对其血清学诊断价值进行了初步研究,为rdESAT-6 抗原在结核病的血清学诊断或在皮肤试验等方面的应用奠定基础。

材料和方法
一、材料

1. 菌株及质粒 大肠埃希菌DH5α、克隆载体pBlue-script ⅡKS (pKS)和高效电转菌株耻垢分枝杆菌mc2155为本室保存;分枝杆菌同源可控表达质粒pMF41为本室范小勇博士构建保存[ 9];MTB H37Rv和DNA疫苗HG856A由上海海规生物科技有限公司提供。

2. 试剂与仪器 限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ和ClaⅠ,T4 DNA连接酶,Pfu DNA聚合酶,低相对分子质量蛋白标准均为MBI Fermentas公司产品;Taq DNA聚合酶、DNA Marker购自TaKaRa公司;Ni-NTA His-Bind Resin 购自Amersham;引物合成和序列测定均由上海英骏生物技术有限公司完成;EAST-6小鼠抗血清由上海海规生物科技有限公司提供;辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记的羊抗鼠IgG 和羊抗人IgG 为Santa Cruz 公司产品;结核斑点金免疫渗滤试验(tuberculosis dot immunogold filtration assay,TB-DOT)诊断试剂盒购自上海奥普生物医药有限公司。

3. 血清标本 2010年9月至2012年3月,上海市公共卫生临床中心收治的126例确诊为结核病的患者血清(其中包括79例MTB检查阳性患者和47例MTB检查阴性患者),以上患者均为结合病史、临床表现、X线检查、细菌学检查及病理组织学检查等临床诊断确诊为结核病的病例[ 10]。同时,收集42名健康体检者的血清。

二、方法

1. 表达质粒的构建 (1) 2× esat-6 基因的聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增:根据GenBank中 esat-6基因(NO: EU702753)序列设计引物,由上海生工生物工程公司合成。引物序列为:P1 esat6-F(BamHⅠ),5'-ATTGGATCCATGACAGAGCAGCAGTGGAAT-TTC-3'; P2 esat6-R (EcoRⅠ),5'- CTCGAATTC-CTATGCGAACATCCCAGTGACG-3'。引物序列中下划线部分分别为BamHⅠ、EcoRⅠ酶切位点。以含2× esat-6基因的HG856A2核酸疫苗质粒DNA为模板,PCR扩增2× esat-6基因,反应条件为:94 ℃预变性4 min;94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s,共30个循环,最后72 ℃延伸5 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定并回收目的片段;(2)pMF41-2× esat-6质粒的构建与转化:为了方便纯化,我们在融合基因的下游设计了含有6×His的pBlue-script ⅡKS (pKS)亚克隆载体。将回收得到的2× esat-6基因与质粒pBlue-script ⅡKS (pKS)分别使用BamHⅠ、EcoRⅠ酶切37 ℃ 3 h;用T4 DNA连接酶将2× esat-6基因与质粒pBlue-script ⅡKS (pKS)连接,构建pKS-2× esat-6亚克隆。用BamHⅠ和ClaⅠ分别双酶切pKS-2× esat-6亚克隆质粒和pMF41质粒,并回收得到2× esat-6基因和pMF41载体片段。2× esat-6基因片段与pMF41载体片段按3∶1的比例混合,加入T4 DNA连接酶22 ℃连接3 h。将连接产物转化到大肠埃希菌DH5α感受态细胞,并涂布在添加卡那霉素(终浓度50 μg/mL)抗性的LB琼脂培养基上,于37 °C培养,12~16 h后观察菌落生长。挑取单克隆菌落培养后抽提质粒,用BamHⅠ和 ClaⅠ双酶切鉴定重组质粒,将重组质粒送交上海英骏生物科技有限公司测序;(3) 电转化构建耻垢分枝杆菌表达菌株:取一支100 μL电转感受态细胞,加入pMF41-2× esat-6重组质粒5 μL,混匀后冰上放置10 min。转移至预冷的2 mm电击杯,设置电转化仪(Gene Pluser Ⅱ, Bio-Rad) 参数为2.5 kV、25 μF、1 000 Ω,放电后立即加入900 μL培养基,混匀后转移至无菌管,于37 ℃摇床温育2 h。涂布含卡那霉素的LBG琼脂培养基,于37°C倒置培养3~5 d后筛选阳性克隆。

2. 重组抗原rdESAT-6的诱导表达和纯化 挑取阳性克隆接种含卡那霉素(50 μg/mL)的LBG液体培养基中,37 ℃、水平摇床(1.16× g)培养2~3 d,以2%转种于2 mL含卡那霉素的LB琼脂中,振荡培养至吸光度( A)600值为0.4左右,加入10%乙酰胺溶液(终浓度为0.02 %)诱导目的基因分别表达重组蛋白rdESAT-6。37 ℃诱导7 h后离心收集菌体。

采用Ni2+-NTA 结合树脂亲和层析纯化重组蛋白。菌体沉淀加入15 mL 裂解液(50 mmol/ L Tris-HCl,100 mmol/L NaCl,pH值 8. 0)重悬,冰浴中超声15 min破菌;4 ℃ 10 000× g 离心30 min,收集包涵体沉淀;用包涵体洗涤液(50 mmol /L Tris-HCl,100 mmol/ L NaCl,1 mmol/L乙二胺四乙酸,0.5% Triton X-100,pH值8. 0)洗涤沉淀2 次,再用裂解液洗涤2 次;将洗涤好的包涵体用包涵体溶解液(50 mmol/L Tris-HCl,100 mmol/L NaCl,8 mol/L尿素,pH值8. 0)充分溶解, 4 ℃ 10 000×g离心30 min,收集上清,加到平衡好的Ni2+-NTA His-Bind Resin 柱内,混匀,收集流穿液;用包涵体溶解液充分洗涤Ni2+柱;用不同pH 值(5. 00、4. 50、4. 25)的洗脱液(50 mmol/L Tris-HCl,100 mmol/L NaCl,8 mol/L尿素)洗脱目的蛋白;十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis,SDS-PAGE) 分析洗脱液,并将纯化的蛋白透析、超滤后蛋白定量,于-80 ℃冰箱保存。

3. 重组蛋白rdESAT-6的抗原性鉴定 纯化蛋白进行SDS-PAGE后,将目的蛋白转移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上。用10 %脱脂奶粉封闭1 h后加入ESAT-6 小鼠抗血清(1∶500 稀释),37 ℃孵育1 h;1×Tris-HCl缓冲盐溶液(0.05 %吐温-20)充分洗涤,加入HRP-羊抗鼠IgG(1∶8 000 稀释),37 ℃孵育45 min;充分洗膜后加入增强型化学发光(enhanced chemical lighten,ECL)底物显影。

4. 重组抗原rdESAT-6 的血清学诊断 以42份健康体检者血清的平均 A值 +2 s为正常界限值[ 10, 11, 12],以rdESAT-6 纯化蛋白为抗原,对126份结核病患者血清进行检测。以0.25 μg/ mL的rdESAT-6纯化蛋白包被96孔酶标板,100 μL/孔,将健康体检者和结核患者血清用含0.5 %牛血清白蛋白(albumin from bovine serum,BSA)的1×含0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液1∶600 稀释,加入酶标板,以HRP-羊抗人IgG(1∶12 500 稀释)为二抗,通过常规酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)测定126例结核病患者(其中包括79例MTB阳性患者和47例MTB阴性患者)和42名健康体检者血清中抗结核抗体水平。同时,采用TB-DOT快速血清诊断试剂盒对126例结核病患者和42名健康体检者的血清进行检测。

结果
一、2× esat-6 基因PCR 扩增产物

经1%琼脂糖凝胶电泳分析,2× esat-6 基因PCR 产物在电泳图上可见大小约为579 bp 的条带,与理论值一致,见图1。

图1 2× esat-6 基因PCR 扩增产物电泳

二、 重组质粒pMF41-2× esat-6的酶切鉴定

筛选的阳性克隆经培养抽提质粒后,经BamHⅠ、ClaⅠ双酶切获得大小约为6 700和579 bp的片段。测序证实2× esat-6基因序列与核酸疫苗中 esat-6基因序列一致,成功构建了pMF41-2× esat-6重组质粒,见图2。

图2 重组质粒pMF41-2× esat-6酶切图谱

三、重组蛋白rdESAT-6 表达、纯化

含重组质粒pMF41-2× esat-6的耻垢分枝杆菌表达菌株,经10%乙酰胺溶液(终浓度为0.02%)诱导7 h后,表达了相对分子质量约22 000的浓重条带,而未经诱导的重组菌没有表达此蛋白,见图3。采用Ni-NTA His结合树脂亲和层析成功纯化得到了重组蛋白rdESAT-6纯度>95%。透析、超滤后经Bradford 法测定,蛋白浓度约为0.5 mg / mL,约占菌体总蛋白的20%。

图3 重组质粒pMF41-2× esat-6的表达情况

四、重组蛋白rdESAT-6的抗原性鉴定

纯化的重组蛋白rdESAT-6 与EAST-6 的小鼠抗血清反应,在相对分子质量约22 000处可见特异性结合条带,见图4,表明重组蛋白rdESAT-6 具有良好的反应原性。

图4 纯化蛋白rdESAT-6 的Western blot 鉴定

五、纯化蛋白rdESAT-6 的初步评价

ELISA检测结果表明,耻垢分枝杆菌表达系统制备的rdESAT-6蛋白在MTB阳性和阴性组患者血清学诊断的敏感性分别为79.75% (63/79)、61.70% (29/47)。TB-DOT试剂盒检测对MTB阳性和阴性组患者血清学诊断的敏感性分别为62.03% (49/79)、44.68% (21/47)。2种检测方法之间差异具有统计学意义( P<0.05)。42名健康体检者血清诊断特异性均达到95.24% (40/42)。见表1。

表1 126例结核病患者和42名健康体检者血清诊断结果分析
讨论

耻垢分枝杆菌是一种非致病性的、比BCG生长快、转化率高的分枝杆菌突变株,该分枝杆菌分子生物学的特征是可使外源基因在其菌细胞内得到表达[ 8]。重组蛋白在宿主菌中表达后可能会有部分氨基酸残基的修饰、加工,这些修饰、加工可能会影响其免疫原性或抗原性。有学者认为,从耻垢分枝杆菌表达系统中表达纯化的重组分枝杆菌蛋白的抗原结构、免疫原性都要远好于从大肠埃希菌表达系统中表达纯化的蛋白[ 13]。因此,寻找较好的结核特异性抗原对于结核病的早期诊断具有非常重要的意义。

MTB早期分泌蛋白ESAT-6 的编码基因由288 bp 组成,含95 个氨基酸,是目前结核病诊断以及疫苗研究的首选抗原。Harboe等[ 14]利用ESAT-6 的单抗HYB76-8 对11 个不同标本进行SDS-PAGE 和Western blot检测,发现只有MTB H37Rv 株、牛分枝杆菌AN5和Ravenel 株3个标本在相对分子质量6 000 处出现目的条带,对其他8 个不同来源的BCG 菌株及一些环境分枝杆菌的不同菌株分析发现,ESAT-6 抗原是区别MTB和非结核分枝杆菌 ( Non-tuberculosis Mycobacterium,NTM)的最佳候选抗原。该试验结果极大地推动了ESAT-6 作为MTB诊断试剂的研究进展。ESAT-6 在MTB 增殖期和非增殖期均高水平的转录,无论是活动性结核病患者还是MTB 潜伏感染者,ESAT-6 均可有效诱导机体的免疫应答。ESAT-6 可能是通过一种非信号肽依赖的形式分泌到细胞外,但效率不高,而B 细胞的激活和增生需较大量抗原的刺激,再加上ESAT-6 的相对分子质量较小,免疫原性较差,这些可能是导致结核病患者血清中抗ESAT-6 抗体水平不高的重要原因[ 15]。

动物实验证明了 esat-6 基因及其表达的ESAT-6抗原作为疫苗组分的重要性。但由于ESAT-6 的相对分子质量较小,导致其免疫原性差,在大动物中却很难诱导出令人满意的免疫应答[ 16, 17, 18]。在以往的研究中构建的含2拷贝 esat-6 的嵌合基因DNA 疫苗HG856A,将 esat-6 基因插入了 ag85 a 基因的Acc Ⅰ位点,与只含1拷贝 esat-6 的核酸疫苗相比,2拷贝 esat-6 的插入增加了其抗原表位,增强了疫苗的免疫原性,因而使得ESAT-6也能在大动物中诱导出良好的免疫应答反应[ 19]。

本研究以核酸疫苗HG856A 质粒DNA 为模板,通过PCR 扩增获得了2× esat-6 基因片段;将构建的pMF41-2× esat-6电转化到耻垢分枝杆菌中,在耻垢分枝杆菌mc2155表达系统中成功制备了rdESAT-6蛋白。N-端携带的6×His 标签,使其可通过镍螯合亲和层析进行纯化。以rdESAT-6纯化蛋白为抗原检测人血清中抗结核抗体,均显示了较好的敏感性和特异性。另外,Western blot结果也证实其具有良好的抗原特异性,如果把rdESAT-6与其他MTB特异性抗原联合使用进行诊断,可能会进一步提高诊断的准确性。

The authors have declared that no competing interests exist.

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