钙敏感受体(calcium sensing receptor,CaSR)是一种G蛋白偶联受体,广泛表达于各种组织器官和细胞中,在各种生命活动和组织器官功能的调节中发挥着重要的作用。CaSR活化后可激活多种信号转导通路,包括核转录因子-κB(nuclear transcription factor kappa B,NF-κB)通路、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)通路等。细胞因子在炎症性疾病中的作用意义重大。深入研究CaSR及其介导的信号转导通路对探讨细胞因子分泌的调控机制、制定炎症性疾病的治疗及预防策略以及相关药物的研发具有重要意义。

1. CaSR的结构特点 CaSR是一种跨膜受体,属于G蛋白偶联受体家族的C家族成员。人类的 CaSR基因位于3号染色体长臂^{[ 1]}。CaSR的拓扑结构由三部分组成^{[ 2]} :(1) 氨基酸端(-NH2)的细胞外区(ECD),由612个氨基酸组成,呈亲水性,含多个N-键连接的糖基化位点,是受体与其激活剂互相结合的位置;(2) 疏水区(TMD),由250个氨基酸残基组成,形成3个细胞内环和3个细胞外环,此区域为G蛋白偶联受体特征性的结构,功能是与其他相关的G蛋白进行细胞间的信号转导;(3) 胞内羧基端(-COOH),由217个氨基酸组成,在胞内环的羧基端隐藏着蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)和蛋白激酶A( protein kinase A,PKA)的磷酸化位点。

2. CaSR的信号转导 细胞外钙离子或其他CaSR激动剂与CaSR结合会引起复杂的信号转导。这种作用主要是通过CaSR介导的细胞内信号蛋白来调节的,包括G蛋白、磷脂酶和MAPK等^{[ 3]}。在稳定表达CaSR的肾细胞中,活化的CaSR可以激活磷脂酶C、A2、D,分别形成三磷酸肌醇(inositol 1, 4, 5-trisphosphate, IP3)和二酯酰甘油、花生四烯酸、磷脂酸,但非转染CaSR的肾细胞则无此作用。因此,有学者推测磷脂酶C、A2、D的激活是CaSR的作用结果。并且CaSR激动剂引起磷脂酶C-IP3的活化和伴随的胞内钙转移在一些类型细胞已经得到阐明,这是G蛋白直接介导的过程^{[ 4]}。Sun等^{[ 5]}研究发现,CaSR活化可引起心肌细胞内钙的增高,促进心肌细胞凋亡,同时CaSR的活化可通过MAPK通道激活细胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)抑制细胞凋亡,两者相互作用,影响细胞的状态。

3. CaSR的生理作用 CaSR是维持体内金属离子稳态、调节激素分泌、激活离子通道的重要受体之一,并且在调节基因表达及诱导细胞凋亡、分化、衰老等过程中均发挥重要作用^{[ 6, 7]} 。CaSR在肾脏、甲状旁腺、心脏等很多组织和细胞中广泛存在。CaSR不仅在调节肾脏功能和体内离子平衡等方面发挥重要作用^{[ 8]},而且在甲状旁腺细胞被钙离子激活后可抑制该细胞的分泌功能,致使甲状旁腺激素(parathyroid hormone,PTH)分泌减少^{[ 9]}。CaSR在多种心血管系统疾病的发生和发展中也发挥重要作用,Wang等^{[ 10]}首次证实CaSR功能性表达于大鼠心肌组织,其主要通过介导磷脂酶C-IP3通路来引起细胞内钙离子的升高。孙轶华等^{[ 11]}证实CaSR的激动剂(gadolinium chloride,GdCl₃)通过升高细胞内钙诱导乳鼠心肌细胞凋亡并通过Fas通路和线粒体通路加重大鼠心肌细胞缺血-再灌注损伤。

细胞因子是由免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物活性的小分子蛋白质,主要调节免疫应答、参与免疫细胞分化发育、介导炎症反应等。细胞因子包括淋巴细胞分泌的淋巴因子、单核巨噬细胞分泌的单核因子以及其他各种生长因子等。体内的各种细胞因子之间有着复杂的相互作用,它们通过合成和分泌的相互调节及受体表达的相互作用形成了十分复杂的细胞因子调节网络,参与人体多种重要的生理功能。

CaSR对免疫炎症反应中细胞因子的分泌水平具有调节作用,此过程涉及多种信号转导通路。CaSR促进巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-alph,TNF-α)和白细胞介素1β(interleukin-1 beta,IL-1β)的过程有磷脂酶C-IP3通路的参与^{[ 12]}。果蝇蛋白WNT(wingless-type MMTV integration site family members)家族是一类富含半胱氨酸的分泌型糖蛋白信号分子。最新研究表明,在小鼠的单核-巨噬细胞中,CaSR激活后可通过WNT相关通路增加该细胞TNF-α的分泌水平^{[ 13]}。除了以上信号转导通路,CaSR介导的NF-κB、MAPK和Janus蛋白酪氨酸激酶/转录激活因子(Janus protein-tyrosine kinase/ signal transducer and activator of t ranscription,JAK/STAT)等信号通路对细胞因子的分泌起到尤为重要的调控作用。

(一)NF-κB通路与细胞因子

核转录因子NF-κB是人类免疫反应的中枢调节剂,其可被多种因素所激活。免疫细胞的活化、淋巴细胞的发育、细胞分化和凋亡等多种细胞活动,都与NF-κB的激活有关系。

通常静息时NF-κB家族成员以同源二聚体或异源二聚体形式与其抑制蛋白(inhibitor of κB,IκB)构成复合物,以非活性形式存在于细胞质中。当细胞上CaSR被激活,依赖泛素蛋白的IκBa激酶发生磷酸化并迅速降解,NF-κB与IκBa解离,NF-κB同源二聚体或异源二聚体因解离而被激活。同时,受刺激的细胞Rel蛋白上的核定位信号露出,激活的NF-κB由胞浆进入细胞核中,结合于特异的DNA结合位点,从而启动炎症性基因的转录,致使炎症性细胞因子分泌增加,引起炎症反应。

T淋巴细胞是淋巴细胞的主要组分,具有多种生物学功能,其在某些病毒或细菌所致的急性传染病和肿瘤中比率明显升高,如风疹、流行性腮腺炎、传染性淋巴细胞增多症、传染性单核细胞增多症、淋巴细胞性白血病、白血病性淋巴肉瘤等。2013年,Li等^{[ 14]}首次证实在人正常外周血T淋巴细胞上存在CaSR,并证实CaSR激活后可通过NF-κB通路促进细胞因子分泌。Gd³⁺作用于人外周血T淋巴细胞后,CaSR mRNA和蛋白的表达都明显升高,细胞因子白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)和肿瘤细胞因子β(tumor necrosis factor-beta,TNF-β)分泌增加,同时检测到NF-κB通道中P65蛋白的磷酸化水平升高,而NF-κB通路抑制剂Bay-11-7082可以使升高的P65蛋白的磷酸化水平回降,并降低IL-6和TNF-β的分泌量。可见T淋巴细胞上活化的CaSR介导NF-κB通路提高细胞因子的分泌水平,并且高水平的淋巴因子使免疫效应扩大和增强,最终抵御机体病毒感染和肿瘤形成。

Cifuentes等^{[ 15, 16]}证实CaSR功能性表达于人类脂肪细胞中,并通过进一步实验观察到在人脂肪细胞株LS14上,CaSR被拟钙剂激活后能够通过NF-κB通路促进细胞因子IL-1、IL-6和趋化因子CCL2的分泌。Xi等^{[ 12]}的研究显示,CaSR激动剂Gd³⁺使单核巨噬细胞株THP-1细胞NFκB-P65蛋白表达明显上调,同时伴有IL-1β、TNF-α的分泌增加;而CaSR抑制剂NPS2390使Gd³⁺所引起的NFκB-P65蛋白和细胞因子的变化被抑制。他们证实在单核巨噬细胞株THP-1细胞上,活化的CaSR介导NF-κB通路分泌的细胞因子广泛参与心血管疾病和相关病理过程,如动脉粥样硬化。IL-1β为一种致炎细胞因子,促进巨噬细胞增殖和巨噬细胞泡沫化,TNF-α促进巨噬细胞来源的泡沫细胞在血管壁的聚集,并诱导血管内皮细胞血小板源生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)的表达及促进血管内皮细胞的生长和增殖,两种细胞因子加剧了心血管动脉内膜下的炎性反应以及动脉粥样斑块的形成,从而参与调节动脉粥样硬化的发生和发展。Smajilovic等^{[ 17]}研究表明,CaSR的激动剂可预防氧化应激,有效改善尿毒症大鼠的心脏间质纤维化和微血管病病变。临床上研究最多的CaSR激动剂是NPS-R-568和AMG073以及其抑制剂NPS2143。可见,CaSR及NF-κB通路的调节剂有望成为治疗心血管疾病的潜在药物。

(二)MAPK通路与细胞因子

MAPK传导通路是介导细胞反应的重要信号系统,其可以调节细胞的生长和分化,活化各种酶和离子通道,尤其在介导炎症反应和细胞因子生成中起着重要的作用。其至少分成3个亚家族:ERK/MAPK族、c-Jun氨基末端激酶/应激活化蛋白激酶(c-Jun N-terminal kinase/stress-activated protein kinase,JNK/SAPK)、P38/MAPK。

2013年,Li等^{[ 14]}证实Gd³⁺使人外周血T淋巴细胞的CaSR mRNA和蛋白的表达都明显升高,细胞因子IL-6和TNF-β分泌增加,同时检测到MAPK通道中ERK蛋白的磷酸化水平升高,而JNK和P38蛋白则无明显变化。MAPK通路抑制剂U0126可以使升高的ERK蛋白的磷酸化水平回降,并降低IL-6和TNF-β的分泌量。Chiarini等^{[ 18]}研究发现,CaSR激活的MAPK信号转导途径可导致阿尔茨海默病( Alzheimer's disease,AD)患者海马和新皮质的乙酰胆碱(acetylcholine,Ach)和胆碱乙酰转移酶(choline acetyl transferase,ChAT)显著减少,但使细胞因子IL-1、白细胞介素2(interleukin-2,IL-2)、IL-6和炎性介质血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)分泌水平升高,同时AD患者脑内神经元退行性改变,患者的渐进性记忆障碍、认知功能障碍、人格改变以及语言障碍等神经精神症状更加明显。另外,有研究表明胰岛细胞分泌TNF-α和IL-1β的过程涉及到MAPK通道的JNK-SAPK和P38/MAPK亚族,胰岛α和β细胞分泌的TNF-α和IL-1β可导致胰岛炎,直接影响胰岛素信号传导过程,使机体葡萄糖动态平衡受损而导致糖尿病的发病^{[ 19]}。P38通路和JNK通路激活后能上调IL-1β诱导的环氧酶(cyclooxygenase,COX)表达,使前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)合成增加,而PGE2与其受体EP3结合,通过环磷酸腺苷cAMP途径抑制胰岛β细胞分泌胰岛素,利用P38/MAPK抑制剂SC68376能完全抑制这种作用^{[ 20]}。Bruder等^{[ 21]}报道,腺病毒感染通过激活ERK通路使细胞产生白细胞介素8(interleukin-8,IL-8)、IL-6和TNF-α,而且在腺病毒急性感染期TNF-α和IL-6水平显著增高。重症腺病毒肺炎患者巨噬细胞合成并分泌大量IL-8、IL-6和TNF-α,直接损伤血管内皮细胞,加重肺组织的损伤,而肺组织的损伤又促使TNF-α因子的释放,形成恶性循环,造成肺炎的反复和持续难愈^{[ 22]},应用ERK/MAPK通路抑制剂U0126可能使腺病毒肺炎好转。临床上,以干预CaSR表达及活性、干预ERK/MAPK通路及P38/MAPK通路活性为视角,为AD、糖尿病、肺炎等疾病的预防和治疗提供新的途径。

(三)JAK/STAT信号通路与细胞因子

JAK和STAT信号通路是重要的细胞因子信号转导途径,其信号通路异常激活与多种自身免疫性疾病的发生有关。CaSR介导的JAK/ STAT 信号通路在促进免疫细胞分化、调节免疫应答、介导炎性反应等过程中发挥重要的生物学作用。

CaSR可激活JAK相关信号转导通路,磷酸化的JAK激活STAT家族成员,使STAT成为二聚体而转移到细胞核内,与特异的STAT反应元件结合而激活相关基因转录,其中Stat1和Stat3元件主要调节细胞因子IL-6的分泌^{[ 23]} 。Harada等^{[ 24]}也观察到系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)患者T淋巴细胞中总STAT3和磷酸化STAT3蛋白的表达水平明显升高,患者的皮损切片中发现了IL-6的高表达。Peng^{[ 25]}发现JAK/STAT信号通路在SLE的发病和病理机制中起重要作用,其患者血清中干扰素(interferon,IFN)及白细胞介素(IL-2、IL-4、IL-6)水平明显高于健康对照者,表明患者体内细胞免疫功能活跃;且SLE活动组血清细胞因子水平明显高于非活动组。在疾病的活动期,机体的免疫功能亢进,活化的CaSR通过JAK/STAT通路促进IL-6、IL-4分泌,致使免疫炎性反应增强,体内产生过强的免疫应答。有研究证实,在正常淋巴细胞IFN、IL-6和IL-10生物学作用的细胞内信号传递机制是通过JAK1、JAK2、STAT通路实现的,而IFN、IL-6、IL-10均在SLE的发病和病理中起重要作用,其中IFN-α水平与受累器官数量呈正相关,也与发热和皮损相关;IFN-γ在疾病晚期阶段肾脏损害较重时表达量升高,可以加速组织损伤和死亡,并且IFN-γ在自身免疫性肾炎的发展中起关键性作用,IFN-γ还可促进IgG2a和IgG3亚类抗体的合成,致狼疮性肾小球肾炎;IL-6与狼疮活动度、血清抗ds-DNA抗体的水平呈正相关,与补体水平呈负相关;IL-10刺激B细胞过度活化,产生大量自身抗体,以致病情加重^{[ 26]}。

SLE是最具代表性的多器官受累的自身免疫性疾病。迄今为止,国内外学者报道的JAK/STAT信号途径在SLE中的变化是磷酸化的STAT1、STAT2在其患者的外周血T细胞中表达升高^{[ 27]}。STAT蛋白磷酸化水平增高,与SLE主要累及小血管的病理特点相一致,提示JAK/STAT途径可能参与了小血管炎的病理过程,从而引起SLE各器官的病理损伤。目前的SLE治疗仍然是以糖皮质激素和环磷酞胺为代表的细胞毒药物为主,人们一直在探索新的抗狼疮药物,而CaSR介导的JAK/STAT信号转导途径在SLE各主要累及器官的发病和病理中可能起重要作用,提示抑制CaSR活性及阻断JAK/STAT通路可能成为治疗SLE的新方法,这对于SLE的治疗将具有重大意义。

(四)G蛋白相关通路与细胞因子

G蛋白即异源三聚体鸟苷酸结合蛋白,也称GTP结合蛋白,广泛存在于组织细胞膜的胞质侧,是膜受体与效应酶之间的偶联蛋白,在跨膜信号转导通路中起分子开关作用。G蛋白由α、β和γ 3个亚基组成,通常根据α亚基的不同,将其分成4类:G(α) s、G(α) i、G(α) q 和G(α) 12/ 13。

在肾小管髓袢升支粗段(medullary thick ascendinglimb,mTAL)细胞,CaSR能够激活Gq蛋白,Gq介导磷脂酶C-β(phospholipase C-beta,PLC-β)活化,调控IP3和二酯酰甘油以及随后的胞内钙离子释放,依赖钙调磷酸酶(calcineurin,CaN)使核因子活性T细胞(nuclear factor activated T cells,NFAT)活化导致TNF-α和PGE2的产生,TNF-α能够诱导肾小管上皮细胞分泌趋化因子CXCL9、CXCL10,在肾移植时CXCL9和CXCL10表达升高,且与移植的急、慢性排斥反应有关,这些研究提示趋化因子CXCL9、CXCL10在肾移植中可能担当重要的角色^{[ 28, 29, 30, 31]},然而应用磷脂酶C-IP3通路抑制剂U73122却能够完全阻止CaSR通过Gq通路介导的TNF的分泌作用^{[ 32]},并且应用CaN类免疫抑制剂[包括环孢素A(cyclosporine A,CsA)、他克莫司(tacrolimus,FK506)]能有效降低急性排斥反应及难治性排斥反应的发生,提高患者及移植肾的早期存活率^{[ 33]}。另外有研究结果显示,在mTAL细胞上,CaSR通过Gi蛋白偶联机制激活的CaN和NFAT以一种PKC依赖的方式增加TNF的基因转录,提高了TNF-α的分泌水平^{[ 34]}。TNF-α使单核细胞化学诱导蛋白(monocyte chemoattractnt protein-1,MCP-1)、细胞间黏附分子-1(inter cellular adhesion molecule-1,ICAM-1)和血管细胞黏附分子-1(vacular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)的表达上调,趋化并黏附大量单核/巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞等炎症细胞浸润至受损肾间质并被激活,释放更多的炎性细胞因子,如IL-1、IL-6等,不仅使炎症反应进一步加强,产生“级联放大”作用,还会加重对肾小管上皮细胞、血管及其周围组织的损伤。损伤和再生的肾小管上皮细胞比正常时产生更多的TNF-α,而TNF-α又能刺激成纤维细胞的增殖,同时介导肾小管上皮细胞转分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),合成大量胶原等细胞外基质成分,加速肾纤维化进程,最终使肾间质纤维化和肾小球硬化^{[ 35]}。以上反应可被CaSR抑制剂NPS2143和Gi蛋白抑制剂百日咳毒素(pertussis toxin,PTX)消除^{[ 34]}。所以干预CaSR及G蛋白相关通路的活性可能是治疗肾小球硬化及延长肾移植者寿命的新策略。

综上所述,CaSR及其介导的信号转导通路对细胞因子的分泌起到调控作用,并在动脉粥样硬化、AD、糖尿病、腺病毒肺炎、SLE、肾小球硬化等疾病的发生和发展过程中发挥重要作用。因此,研究CaSR及其介导的相关信号转导通路对细胞因子分泌的调控机制具有重要意义。CaSR广泛存在于生物体中。为了深入揭示CaSR的生理功能及其相关通路的作用机制,需采用转基因、基因沉默以及microRNA等技术,或是寻找安全、高效的CaSR及其相关通路调节剂进一步深入开展相关研究,为预防和治疗相关疾病提供新的视角和依据。

(收稿日期:2013-08-09)

(本文编辑:姜 敏)