潘某,女,48岁,浙江省青田县人。2011年2次在当地医院行妇科手术,2次手术中均有输血史,于9月2日出院。2011年10月13日因“发热待查”收住丽水市人民医院感染科。

入院查体:体温36 ℃,血压17.3/14.3 KPa,贫血貌,精神欠佳,两肺呼吸音粗,未闻及干湿罗音,腹软,无压痛。实验室检查:血、痰细菌培养阴性,网织红细胞0.062,血沉117 mm/h,高敏C反应蛋白(hs-CRP) 80.0 mg/L,丙氨酸氨基转移酶49 U/L,天门冬氨酸氨基转移酶940 U/L,间接胆红素8.8 μmol/L。腹部CT示:胆囊炎、肝脾肿大;胸部CT示:两侧胸腔少量积液,左肺上叶舌段少量纤维化病灶。因“反复不规则发热、重度贫血、肝脾肿大”行骨髓穿刺检查,骨髓涂片发现大量拟似疟原虫的虫体。疟疾OPtiMAL-IT 金标法快速检测试剂结果:仅在“C”处出现红色反应线,表明样本为疟原虫阴性。

一、对象

抽取患者外周血、骨髓。用BECKMAN-COULTER LH750全自动血液分析仪及原装试剂检测血常规;外周血片、骨髓片用瑞氏染液染色后观察虫体形态。

二、分子生物学检测

根据疟原虫快速检测阴性结果和虫体形态特点,初步怀疑感染的虫体可能为巴贝斯虫。为此,标本送省疾控中心进行多重聚合酶链反应(PCR)扩增。 DNA抽提试剂盒购自Omega公司,PCR扩增试剂盒购自大连宝生物工程有限公司。用DNA抽提试剂盒提取患者来丽水市人民医院就诊时第1次血样本的基因组DNA。分别用疟原虫引物和巴贝斯虫引物进行PCR扩增,疟原虫引物见参考文献^{[ 1]},巴贝斯虫的属特异引物^{[ 2]}为正向引物F:5'-GACACAGGGAGGTAGTGACAACG-3',反向引物R:5'-CTAAGAATTTCACCTCTGACAGT-3';巴贝斯虫的种特异引物为正向引物F:5'-AAGCCATGCATGTCATGTCTAAGTATAAGCTTTT-3', 反向引物R:5'-CTTCTCCTTCCTTTAAGTGATAAGGTTCAC-3'。分别扩增疟原虫、巴贝斯虫属和巴贝斯虫种的基因片段,实验设疟原虫阳性对照和空白对照。PCR反应体系:10 buffer 5 μL,320 mol/L dNTP上下游各1 μL,TaqDNA聚合酶3 U,模板DNA 2 μL,加双蒸水至50 μL;反应条件为预变性94 ℃ 3 min;94℃ 30 s,55 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,循环40次,72 ℃7 min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析,经纯化并且送生工生物公司测序,测序结果采用BLAST序列比对分析其同源性。

红细胞(RBC) 2.59×10¹²/L,血红蛋白(Hb) 5.5 g/L,RBC体积分布宽度(RDW) 23.1%,RBC直方图波峰降低,曲线变宽,见图 1。

图1

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	图1 RBC直方图

血小板(PLT) 155×10⁹/L,直方图无异常,见图2。

图2

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	图2 PLT直方图

白细胞(WBC) 4.5×10⁹/L,VCS散点图非WBC区显示大量颗粒,见图3,仪器报警“细胞干扰”。

外周RBC感染率9%、骨髓涂片RBC感染率37%,虫体各期形态见图4。

提取患者治疗前外周血样的基因组DNA,用巴贝虫属引物进行扩增,出现条带,位于约400 bp;用田鼠巴贝虫种引物进行扩增,出现条带,位于约1 600 bp,见图5。PCR产物纯化后经双向测序,其中巴贝斯虫属引物扩增序列为449 bp, 测序结果经BLAST序列比对, 巴贝斯虫属引物扩增序列与巴贝斯虫(登录号为HQ187781)的同源性为96%。田鼠巴贝斯虫种引物扩增序列为1 625 bp,测序结果经BLAST序列比对,与田鼠巴贝斯虫(登录号为AB241632)序列比对,同源性为99%。

图3

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	图3 WBC VCS散点图

图4

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	图4 虫体各期形态(瑞氏染色,×1 000)

图5

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	图5 PCR检测结果

巴贝虫病在美洲、欧洲和亚洲部分地区均有报道,我国内蒙古、黑龙江已有人感染巴贝西原虫病例的存在,浙江亦有零星病例报道^{[ 3]}。

田鼠巴贝斯虫是目前已知的五种可使人致病的巴贝斯虫之一,带虫啮齿类动物如田鼠等是其传染源。硬蜱既是巴贝虫的传播媒介,又是其储存宿主。当具有感染性的子孢子随蜱的唾液侵入哺乳动物体内后,在RBC中以二分裂或出芽方式进行裂殖生殖,产生裂殖子,RBC破裂后释放出的裂殖子再侵入新的RBC,如此反复分裂最后形成配子体。另外,通过输血和胎盘可引起人与人之间的传播,通常免疫功能低下者更容易感染^{[ 4]}。

患者曾在多家医院多次做血常规检查,均漏检,分析原因主要是实验者对巴贝斯虫感染者的血常规参数及图形缺乏经验。虫体在RBC内生长、繁殖,使被感染RBC肿胀、增大,最终破坏,反映在RBC参数与直方图上,表现为RDW增大,直方图波峰降低、变宽。RBC在溶血剂的作用下溶解,而田鼠巴贝斯虫不能被有效破坏,因其体积一般<35 fL,在VCS散点图上分布在非WBC区,即在左下角出现大量颗粒。有学者认为,疟原虫感染者血常规VCS散点图左下角非WBC区出现大量颗粒,敏感性达到100%^{[ 5]}。结合患者有不规则发热、贫血等临床症状,实验者有必要镜检找虫体,以免漏检。一般认为疟原虫感染者PLT数量减少,此例患者PLT数量并不减少,其机理有待更多的病例积累与基础研究。

子孢子呈梨籽形,胞核着色较深,紫红色,多偏一侧,胞质量少,浅灰色,空泡不明显,被感染RBC内含1~23个不等,少数RBC内可达50个以上,需与点彩RBC区别。子孢子侵入RBC,在RBC内进行裂殖,产生的裂殖子、配子体核1~2个,着色偏红,胞质较丰富,灰蓝色,空泡明显,每个受染的RBC内含1~4个,形态似恶性疟原虫的环状体,容易导致误诊。巴贝斯虫和疟原虫形态上的区别主要有2点,第一,巴贝斯虫感染的RBC内看不到疟色素;另外,恶性疟原虫感染以环状体多见,一般每个RBC内不超过5个,而巴贝斯虫感染,1个RBC内可以看到各期虫体,数量可达数十个,并易见虫体感染幼RBC。

患者血常规参数、散点图和形态与实验室常见的疟原虫感染相似,诊断与鉴别诊断主要依靠分子生物学方法。设计了巴贝斯虫属引物和巴贝斯虫种引物,用患者血样提取的核酸进行PCR,扩增出产物,产物经纯化测序,测序结果进行BLAST序列比对,比对结果显示与巴贝斯虫属和田鼠巴贝斯虫种序列同源性分别为96%和99%,至此确诊该患者为田鼠巴贝斯虫感染。

(收稿日期:2013-09-19)

(本文编辑:范基农)