引用本文
李利燕, 李洪春, 马萍. 穿心莲内酯在铜绿假单胞菌诱导的大鼠肺部感染模型中的抗炎作用及其作用机制. 检验医学,2014, 29(5): 535-539
LI Liyan, LI Hongchun, MA Ping. The anti-inflammatory role and mechanism of andrographolide on Pseudomonas aeruginosa-induced lung inflammation in rat model.Labratory Medicine, 2014, 29(5): 535-539  
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穿心莲内酯在铜绿假单胞菌诱导的大鼠肺部感染模型中的抗炎作用及其作用机制
李利燕1, 李洪春2, 马萍2
1. 徐州医学院医学技术学院,江苏 徐州 221004
2. 徐州医学院附属医院检验科,江苏 徐州 221002

作者简介：李利燕,女,1986年生,硕士,主要从事临床检验工作。

摘要

目的

探讨穿心莲内酯在大鼠铜绿假单胞菌(PA)肺部感染时的抗炎作用及可能的机制。

方法

采用气管滴注法建立大鼠PA肺部感染模型。先分为不同时间感染组(0、24、48、72和96 h),分别取大鼠静脉血及肺泡灌洗液进行白细胞计数及分类计数,并用逆转录-聚合酶链反应(PCR)检测肺组织匀浆中Toll样受体4(TLR4)的变化,选一峰值时间点;后分为感染组、溶剂组和给药组(5、10、15和20 μg/g体重给予穿心莲内酯),于峰值点取上述标本做相应指标检测。

结果

PA感染后,大鼠血液白细胞总数于24 h下降,随后上升,于48 h达峰值;肺泡灌洗液细胞总数上升,于48 h达峰值。48 h组血白细胞、肺泡灌洗液白细胞和肺组织匀浆液中TLR4 mRNA水平较其他组高;给予穿心莲内酯后血液白细胞、肺泡灌洗液细胞总数和TLR4 mRNA有不同程度下降,呈剂量依赖关系。

结论

PA肺部感染可引起TLR4 mRNA的改变,穿心莲内酯可有效抑制PA感染引起的肺部炎症反应,其可能通过调控TLR4 mRNA的表达来实现。

关键词: 铜绿假单胞菌; 肺部感染; 穿心莲内酯; Toll样受体4
中图分类号:R446.5 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2014)05-0535-05
The anti-inflammatory role and mechanism of andrographolide on Pseudomonas aeruginosa-induced lung inflammation in rat model
LI Liyan1, LI Hongchun2, MA Ping2
1.College of Medical Technique, Xuzhou Medical College, Jiangsu Xuzhou 221004, China
2. Department of Clinical Laboratory, the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Jiangsu Xuzhou 221002, China
Abstract

Objective

To investigate the anti-inflammatory role and mechanism of andrographolide onPseudomonasaeruginosa (PA)-induced lung inflammation in rats.

Methods

The rat's model of PA-induced lung inflammation was established and classified into different time groups(0, 24, 48, 72 and 96h). The white blood cell count and leukocyte classification were determined in blood and bronchoalveolar lavage fluid. Reverse transcription polymerase chain reaction (PCR) was used to determine the level of Toll-like receptor 4 (TLR4) in lung tissue, a peak time point was selected, and the subjects were classified into infection group, solvent group and treatment group(5, 10, 15 and 20μg/g body weight for andrographolide), and the rat blood, bronchoalveolar lavage fluid and lung tissue at the peak time point were used for testing various indicators.

Results

After PA inflammation, the white blood cell count decreased in 24 h, then increased and reached the peak point at 48 h . The total cell count in bronchoalveolar lavage fluid reached the peak point at 48 h. The mRNA expressions of TLR4 in white blood cell, bronchoalveolar lavage fluid and lung tissue were higher than the others. After receiving andrographolide, the white blood cell count, the total cell count of bronchoalveolar lavage fluid and TLR4 mRNA decreased to various degrees, and had dose-dependent manner.

Conclusions

PA-induced lung inflammation is related with TLR4 mRNA expression changes, and andrographolide can effectively suppress lung inflammation induced by PA. Its anti-inflammatory mechanism may be achieved through the regulation of TLR4 mRNA expression.

Keyword: Pseudomonas aeruginosa; Lung inflammation; Andrographolide; Toll-like receptor 4

铜绿假单胞菌( Pseudomonas aeruginosa, PA)属革兰阴性非发酵杆菌,是一种条件致病菌,当机体抵抗力下降时可引起消化道、呼吸道、伤口创面等感染,甚至引起菌血症。近年来,由于抗菌药物的滥用,PA对抗菌药物的耐药率不断增加,同时多重耐药株也不断增加,给临床治疗带来极大的挑战[ 1]。穿心莲内酯为爵床科植物穿心莲的二萜内酯类化合物,具有抗菌消炎、保肝利胆、抗肿瘤、止咳平喘等作用,临床上常用于治疗多种感染性疾病,如上呼吸道感染、痢疾等。我们利用大鼠PA肺部感染模型,观察PA感染肺组织Toll样受体4(Toll like receptor 4, TLR4) mRNA的变化,探讨穿心莲内酯在PA诱导的大鼠肺部感染模型中的抗炎作用及其机制。

材料和方法

一、动物和菌种

健康雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠,体重200~250 g,由徐州医学院实验动物中心提供。黏液型PA由徐州医学院附属医院检验科提供。穿心莲内酯购自上海研域生物科技有限公司。

二、方法

1.试验分组 15只大鼠随机分为0、24、48、72和96 h组;18只大鼠随机分为PA感染组、溶剂组、给药组(按5、10、15和20 μg/g体重给予穿心莲内酯)。

2.PA生理盐水菌悬液的制备 将PA菌株接种到羊血琼脂培养板上,37 °C恒温箱孵育18~24 h;用无菌牙签挑取PA菌落放入2 mL生理盐水中,混匀后3 200× g离心10 min,弃去上清,加入2 mL生理盐水,混匀,用CrytalspecTM比浊仪(美国BD公司)测定菌液浓度,并调整浓度至2×108 CFU/mL。

3.动物模型制备 采用腹腔注射方式给予10%水合氯醛麻醉大鼠(0.35 mL/100 g体重),固定后暴露会厌,气管插管,吸取20 μL PA菌悬液注入气管,拔出插管,待大鼠苏醒后放入笼中,自由取食。穿心莲内酯通过腹腔注射给予。

4.大鼠血液及肺泡灌洗液白细胞计数 采用腹腔静脉取血方式取全血置乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)抗凝管内。然后将大鼠麻醉固定,立即进行气管分离,行气管插管,打开胸腔,于右肺门处结扎右肺,剪下右肺组织放入冻存管,置于液氮罐中(供肺组织匀浆用于TLR4 mRNA测定);立即用生理盐水1 mL对左肺进行肺泡灌洗,回收率>80%,重复3次,收集肺泡灌洗液。用Sysmex XE-5000血液分析仪检测血液和肺泡灌洗液白细胞总数及分类绝对值计数。

5.TLR4的检测 采用逆转录-聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测。引物委托上海生物工程服务有限公司合成。TLR4引物:上游5'-TCATCAGTGTATCGGTGGTC-3';下游5'-TTTCATCTGGATTCAAGG -3';[ 2]β-actin引物:上游5'-CCTCATGAAGATCCTGACCG-3';下游5'-ACCGCTCATTGCCGATAGTG -3'[ 3]。TLR4反应条件:95 ℃预变性30 min,95 ℃变性30 s,63 ℃退火20 s,72 ℃延伸45 s,40个循环;β-actin反应条件:94 ℃预变性3 min,9 ℃变性30 s,48 ℃退火30 s,72 ℃延伸45s ,30个循环,72 ℃延伸5 min。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

三、统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行统计分析。电泳条带密度值以灰度×面积/参照物的值表示,所有数据以x- ±s表示,采用单因素方差分析和多组间两两比较的 q检验进行统计。 P< 0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、大鼠血液白细胞计数及分类计数

PA感染后白细胞总数24 h下降( P<0.05),之后上升,于48 h达一峰值点( P<0.05);中性粒细胞绝对值计数于感染后48 h上升达峰值( P<0.05),淋巴细胞绝对值计数在感染后先下降,随后逐渐上升( P<0.05);中性粒细胞与淋巴细胞比值于感染后先逐步上升,后于96 h显著下降( P<0.05),见表1。给药后,穿心莲内酯各剂量组白细胞总数较PA感染组和溶剂组明显下降( P<0.05),且呈剂量依赖关系;中性粒细胞和淋巴细胞绝对值计数也呈现相同的变化趋势,见表2。

表1 PA感染后血液白细胞数及分类计数 (x- ±s)
表2 给予穿心莲内酯后大鼠血液白细胞数及分类计数 (x- ±s)

二、肺泡灌洗液白细胞总数计数及分类计数

细胞总数于感染后24 h明显上升( P<0.05),48 h上升达一峰值,之后逐步下降;单个核细胞逐步上升,于72 h达峰值,96 h下降;多个核细胞上升明显,于48 h达峰值,见表3。给药后,穿心莲内酯各剂量组肺泡灌洗液细胞总数较PA组和溶剂组均明显下降( P<0.05),且呈剂量依赖关系,见表4。

表3 PA感染后肺泡灌洗液细胞总数计数及分类计数 (x- ±s)
表4 给予穿心莲内酯后肺泡灌洗液细胞总数计数及分类计数 (x- ±s)

三、 肺组织TLR4 mRNA的变化

与0 h组(0.09)比较,PA感染后TLR4 mRNA表达上升,24 h组(0.83)、48 h组(1.03)、72 h组(0.39)、96 h组(0.38)TLR4 mRNA表达明显升高( P<0.05),且48 h组较其他组升高更为明显( P<0.05),见图1、图2。给药后,穿心莲内酯各剂量组肺组织TLR4 mRNA的表达水平较PA感染组(1.13)、溶剂组(1.12)明显下降,TLR4 mRNA水平的表达下降呈明显的剂量依赖关系[5 μg/g(0.84)、10 μg/g(0.51)、15 μg/g(0.43)],各组间比较差异有统计学意义( P<0.05),但20 μg/g(0.42)组与15 μg/g组之间TLR4 mRNA的表达水平无明显变化( P>0.05),见图3、图4。

图1 PA感染后不同时间TLR4 mRNA PCR凝胶电泳图

图2 PA感染后TLR4 mRNA密度值直方图

图3 给予穿心莲内酯后TLR4 mRNA凝胶电泳图

图4 给予穿心莲内酯后TLR4 mRNA密度值直方图

讨 论

PA是临床常见的条件致病菌,也是近年来引起医院感染的重要病原菌,有文献报道PA在痰液标本中分离率最高[ 4]。近年来,由于抗菌药物的不规范使用和侵入性诊断及治疗手段的增加等,PA的耐药率不断升高。有研究显示分离的936株PA对11种常用的抗菌药物均呈现不同的耐药性,且为多重耐药[ 5]。目前,一些具有抗菌作用的中药已经在临床得到应用,但作用机制仍不清楚,许多抗菌中药能够显著的抑制病原菌感染,改善病原菌引起的器官损害,而且不引起病原菌的耐药,研究抗菌中药及其抗菌机制将会给治疗PA感染提供新的思路和治疗靶点。

有研究称穿心莲内酯对PA的生长状态无明显影响[ 6],但穿心莲内酯与环丙沙星联合应用可恢复环丙沙星对生物被膜PA的杀菌作用,说明穿心莲内酯的抗菌作用并非直接通过杀菌或抑菌实现的,提示穿心莲内酯有可能是通过其他途径而实现其抗感染作用的。本研究利用气管滴注法建立PA的大鼠肺部感染模型,通过检测血液和肺泡灌洗液中炎症细胞的变化,观察穿心莲内酯在PA所致的肺部感染中的抗炎作用,并初步探讨穿心莲内酯的抗炎作用与TLR4 mRNA的关系。

本研究PA感染不同时间段中,大鼠血液白细胞计数、肺泡灌洗液细胞总数和TLR4 mRNA的表达均于48 h达峰值点,因此选取48 h用于后续试验;给药48 h后,在不同剂量穿心莲内酯组,血液中白细胞计数、中性粒细胞绝对值计数均有不同程度的下降,呈剂量依赖关系;穿心莲内酯各剂量组的肺泡灌洗液中,细胞总数较PA感染组、溶剂组下降,且各剂量组间,随着剂量的增加,细胞总数逐步下降。上述结果提示穿心莲内酯能够有效的抑制PA导致的肺部炎症反应,减轻炎症因子的渗出,改善炎症因子导致的肺部损害。

TLR4是已发现的人类第1个Toll样受体家族成员,TLR4与相应配体结合后可以通过MyD88依赖性途径或MyD88非依赖性途径激活下游信号通路,如蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)、核转录因子-κB(nuclear transcription factor kappa B , NF-κB)、干扰素调节因子-3(IFN-regulated factor-3, IRF3)等信号通路,通过激活这些信号通路诱导炎症细胞释放炎症因子,从而介导炎症反应。Ramphal等[ 7]发现TLR4表达缺失的大鼠对PA不易感,并且能够产生有效的天然免疫清除大鼠体内PA。本研究利用逆转录PCR对穿心莲内酯抑制PA感染的作用及与TLR4 mRNA水平变化的关系做了初步探讨。结果显示,给予不同剂量穿心莲内酯(5、10和15 μg/g)后,随着剂量的增加,TLR4 mRNA的表达下降。当给予20 μg/g的穿心莲内酯时,TLR4 mRNA的表达不再变化,说明在给予15 μg/g的穿心莲内酯时就可以充分发挥其抑制TLR4 mRNA表达的作用。

目前,对于穿心莲内酯的抗炎作用机制说法不一,尚没有定论。巨噬细胞是重要的免疫细胞,能够直接吞噬病原体、异物和变异的细胞。有研究发现,穿心莲内酯能抑制脂多糖活化的细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal regulated kinase 1/2, ERK1/2)信号转导通路,通过抑制ERK1/2的磷酸化,从而抑制肿瘤坏死因子(tumor necross factor-alpha,TNF-α)的表达,抑制炎症因子的释放,减轻组织损伤[ 8]。刘江等[ 9]研究表明,穿心莲内酯能够抑制PA生物被膜的形成,该作用是通过抑制生物被膜基因表达来实现的,但具体机制尚不明确,有待进一步研究。另有研究称穿心莲内酯能够抑制PA毒力因子的产生,从而实现其抗感染作用,机制可能是通过抑制PA的密度阈值感应系统(quorum sensing, QS)来抑制毒力因子的产生,在应用QS系统抑制剂后,PA毒力因子的表达下降[ 10]。本研究采用逆转录PCR检测TLR4 mRNA表达变化,在给予不同剂量穿心莲内酯后,各剂量组TLR4 mRNA的表达水平有所下降,提示穿心莲内酯的抗炎作用可能是通过抑制TLR4 mRNA的表达来实现的。

综上所述,对于PA引起的肺部感染,本研究结果提示穿心莲内酯可以起到较好的抗炎作用,能够减轻PA引起的肺部炎症反应,且穿心莲内酯的抗炎作用可能是通过调节TLR4 mRNA 的表达来实现的。在后续的研究阶段,我们将继续探讨穿心莲内酯调节TLR4 mRNA表达后的下游MAPK或NF-κB信号转导通路。针对TLR4 mRNA的调控或许是治疗PA感染新的靶点之一,是对抗菌药物治疗的一个有力补充,有望提高肺部感染治疗的效果。

(收稿日期:2013-07-15)

(本文编辑:姜 敏)

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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