引用本文
倪颖华, 施幼豪. 高危型HPV DNA检测负荷量及其最佳阈值在宫颈癌前病变中的应用研究. 检验医学,2014, 29(5): 501-504
NI Yinghua, SHI Youhao. Application research on virus load and optimal threshold for the detection of high risk HPV DNA in cervical precancerous lesion.Labratory Medicine, 2014, 29(5): 501-504  
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高危型HPV DNA检测负荷量及其最佳阈值在宫颈癌前病变中的应用研究
倪颖华, 施幼豪
复旦大学附属妇产科医院检验科,上海 200011

作者简介：倪颖华,女,1985年生,学士,技师,主要从事人乳头瘤病毒感染的检测与研究。

摘要

目的

探讨高危型人乳头瘤病毒(HPV)DNA检测中的负荷量和最佳阈值在宫颈癌前病变中的应用。

方法

检测805例非宫颈癌患者HPV DNA,同时通过阴道镜活检进行病理学诊断。根据病理结果将患者分为正常无病变组86例、慢性宫颈炎组492例、低度鳞状上皮内病变(LSIL)组117例、高度鳞状上皮内病变(HSIL)组110例。比较各组HPV DNA阳性率,采用受试者工作特征(ROC)曲线确定HPV DNA判断宫颈鳞状上皮内病变的最佳RLU/CO值。

结果

正常无病变组、慢性宫颈炎组、LSIL组、HSIL组HPV DNA阳性率分别为20.93%、34.96%、75.21%、95.45%,高危型HPV DNA负荷量(中位数)分别为0.355 0、0.455 0、47.41、286.68。将宫颈鳞状上皮内病变的HPV DNA负荷量从小到大数量分级,其检测异常率分别为8.29%、24.42%、48.94%、59.66%、68.54%。根据ROC曲线结果,判断宫颈鳞状上皮内病变的最佳RLU/CO值为3.155 0,该值的敏感性为82.2%、特异性为73.9%、Youden指数为1.561;判断HSIL的最佳RLU/CO值为5.965 0,该值的敏感性为92.0%、特异性为68.8%、Youden指数为1.608。

结论

宫颈鳞状上皮内病变患者的高危型HPV DNA负荷量与宫颈病变的检测阳性率呈正比。适当提高最佳RLU/CO值,能够提高检测的特异性,降低宫颈鳞状上皮内病变的假阳性率。

关键词: 人乳头瘤病毒; 高危型; 宫颈癌前病变
中图分类号:R373.9 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2014)05-0501-04
Application research on virus load and optimal threshold for the detection of high risk HPV DNA in cervical precancerous lesion
NI Yinghua, SHI Youhao
Department of Clinical Laboratory, Obstetrics and Gynecology Hospital of Fudan University, Shanghai 200011, China
Abstract

Objective

To investigate the application of virus load and optimal threshold for the detection of high risk human papillomavirus(HPV) DNA in cervical precancerous lesion.

Methods

A total of 805 patients without cervical cancer were performed HPV DNA detection and pathological diagnosis through colposcope biopsy. According to the pathological results, the patients were classified into 86 cases without lesion, 492 cases of chronic cervicitis, 117 cases of low-grade squamous intraepithelial lesion (LSIL)and 110 cases of high-grade squamous intraepithelial lesion (HSIL). The HPV DNA positive rate in each group was compared, and the receiver operating characteristic (ROC) curve was used to determine the optimal RLU/CO value of HPV DNA in cervical squamous intraepithelial lesion.

Results

The positive rates of HPV DNA detection in no lesion group, chronic cervicitis group, LSIL group and HSIL group were 20.93%, 34.96%, 75.21% and 95.45%, and the virus loads (means) of high risk HPV determination results were 0.355 0,0.455 0,47.41 and 286.68. The testing results of cervical squamous intraepithelial lesion were ordered according to the virus loads from small to big, and the abnormal detection rates were 8.29%, 24.42%, 48.94%, 59.66% and 68.54%. According to the ROC curve, the optimal RLU/CO value of cervical squamous intraepithelial lesion was 3.155 0, the sensitivity of the point was 82.2%, while the specificity was 73.9%,and the Youden index was 1.561. The optimal RLU/CO value of HSIL was 5.965 0, the sensitivity of the point was 92.0%,while the specificity was 68.8%, and the Youden index was 1.608.

Conclusions

The virus load of high risk HPV DNA is directly proportional to the positive rate of cervical lesion detection. Increasing the optimal RLU/CO value properly could improve the specificity and decrease the false positivity of cervical squamous intraepithelial lesion.

Keyword: Human papillomavirus; High risk; Cervical precancerous lesion

人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)是由二十面体病毒颗粒组成,包含一个8 000个碱基对双链螺旋DNA分子,外包一个蛋白质壳体。存在于女性产道中的某些类型的HPV与许多疾病有关,包括湿疣、Bowen氏病样丘疹及宫颈、阴道和外阴内上皮瘤病变和癌瘤[ 1, 2]。HPV感染上皮细胞后,病毒DNA完全植入整个上皮层,但是完整病毒颗粒仅在该组织上层发现。因此,病毒DNA能够在病毒颗粒中发现,或在游离及完整的HPV序列中发现。但具体在哪里发现取决于上皮病变的级别和类型。HPV中易引起高度病变的高危型HPV是公认的易引发宫颈癌的危险因素[ 3, 4]。我们通过联合高危型HPV DNA检测及阴道镜病理检查结果来探讨高危型HPV DNA检测中的负荷量和最佳阈值在宫颈癌前病变中的应用。

材料和方法

一、研究对象

选取复旦大学附属妇产科医院2013年7月至8月的门诊非宫颈癌患者805例,年龄18~76岁,均有阴道镜检查的病理记录,用第2代杂交捕获法(hybrid capture 2,HC2)宫颈采样器(宫颈刷和标本转移培养基)采集和转移标本,并由专人运送至检验科进行检测。

二、方法

1.HPV DNA检测 一次性检测13种高危型HPV DNA(包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、58、59和68型)。但不能单一分型。任何1种高危型HPV DNA高于阈值均视为检测阳性。高危型HPV DNA试剂盒及DML2000荧光光度仪均由德国Quigene公司生产。检测步骤:(1)碱性溶液破坏病毒DNA双链,释放并分解为核苷酸单链;(2)DNA单链与RNA探针结合为RNA-DNA杂交复合物;(3)第1抗体(特异性抗体)将RNA-DNA杂交复合物固定在微孔壁上;(4)结合有碱性磷酸酶的多个第2抗体与RNA-DNA杂交复合物结合使信号放大;(5)碱性磷酸酶使酶底物发光,判读荧光强弱可确定碱性磷酸酶的含量从而确定RNA-DNA的含量;(6)结果判定,阳性检测阈值RLU/CO=1.00。

2.阴道镜下取组织进行活检 采用阴道镜放大10~40倍,辅助醋酸试验及卢戈氏试验,对宫颈进行多点活检,标本固定于10%福尔马林液中送病理科做石蜡切片,常规苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosinstaining,HE)染色检查。按病理结果将805例非宫颈癌患者分为正常无病变组86例、慢性宫颈炎组492例、低度鳞状上皮内病变(LSIL)组117例、高度鳞状上皮内病变(HSIL)组110例。

三、统计学方法

运用SPSS 20.0软件进行统计分析。HPV DNA负荷量呈偏态分布,采用中位数(范围)表示,组间比较采用非参数Kruskal-Wallis检验及卡方检验。采用受试者工作特征(ROC)曲线确定HPV DNA判断宫颈鳞状上皮内病变的最佳RLU/CO值并计算灵敏度和特异性。 P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、4种不同程度宫颈病变高危型HPV DNA负荷量比较

LSIL组及HSIL组高危型HPV DNA负荷量明显高于正常无病变组及慢性宫颈炎组( P<0.05),HSIL组明显高于LSIL组( P<0.05),但正常无病变组与慢性宫颈炎组之间差异无统计学意义( P>0.05)。见表1。

表1 4种不同程度宫颈病变高危型HPV DNA负荷量比较

二、宫颈鳞状上皮内病变的高危型HPV DNA阳性率与负荷量数量分级的比较

HPV DNA负荷量的不同分级之间宫颈鳞状上皮内病变阳性率差异有统计学意义( P<0.05)。通过回归曲线拟合检验阳性率, R2=0.970, F=25 668.181, P<0.05。由此可见,随着HPV负荷量的增加,宫颈鳞状上皮内病变的阳性率随之提高,病理检测结果为宫颈鳞状上皮内病变的患者比例也随之升高,两者之间呈线性相关。见表2。

表2 宫颈鳞状上皮内病变的高危型HPV DNA阳性率与负荷量数量分级的比较(例)

三、高危型HPV DNA负荷量判断宫颈鳞状上皮内病变阈值的确定

由于正常无病变组与慢性宫颈炎组的高危型HPV DNA负荷量差异无统计学意义( P>0.05),所以根据阴道镜活检的病理结果,以正常无病变及慢性宫颈炎为阴性,以宫颈鳞状上皮细胞内病变(LSIL、HSIL)为阳性,绘制ROC曲线。高危型HPV DNA负荷量判断宫颈鳞状上皮内病变阈值的ROC曲线见图1,曲线下面积为0.819。以Youden指数最大的切点为最佳值,确定判断宫颈鳞状上皮内病变的最佳RLU/CO值为3.155 0,该值的敏感性为82.2%、特异性为73.9%,Youden指数为1.561。

图1 高危型HPV DNA判断宫颈鳞状上皮细胞内病变的ROC曲线

由于HSIL更容易发展成浸润癌,所以以HSIL为阳性,其余宫颈癌前病变为阴性,绘制ROC曲线,曲线下面积为0.829,见图2。以Youden指数最大的切点为最佳值,确定判断HSIL的最佳RLU/CO值为5.965 0,该值的敏感性为92.0%、特异性为68.8%、Youden指数为1.608。高危型HPV负荷量预测HSIL的阈值要更高,敏感性也更高,但特异性有所下降。

图2 高危型HPV DNA判断HSIL的ROC曲线

讨 论

本研究结果显示,随着宫颈病变情况的不同,其高危型HPV DNA负荷量的中位数也会随之发生变化。通过对4种不同程度宫颈病变之间高危型HPV DNA负荷量的比较,发现正常无病变者与慢性宫颈炎患者之间HPV DNA负荷量差异无统计学意义( P>0.05),但远远低于HSIL及LSIL。HSIL的HPV DNA负荷量明显高于LSIL。由此可见,高危型HPV DNA负荷量的高、低对反映宫颈病变的情况有一定的临床意义,尤其是在宫颈鳞状上皮内病变时,高危型HPV DNA负荷量的变化更为明显。分析宫颈鳞状上皮内病变的阳性率与高危型HPV DNA负荷量数量分级之间的关系,发现高危型HPV DNA负荷量与宫颈鳞状上皮病变的阳性率呈线性相关,说明在感染了高危型HPV后,随着HPV DNA负荷量的上升,宫颈鳞状上皮内病变的例数也随之上升。宫颈鳞状上皮内病变作为宫颈癌变前的前驱病变,高危型HPV DNA检测对于防治宫颈癌来说有着重要的临床意义。研究发现持续性的高危型HPV感染可能引发宫颈鳞状上皮内病变,增加宫颈癌的患病风险[ 3, 4]。如果能提高检测的效率,将大大减少患宫颈恶性病变的风险。

本研究发现通过改变判断宫颈鳞状上皮内病变的高危型HPV DNA负荷量的最佳阈值,将有利于提高检测的效率。若以厂商推荐的1.0为阳性阈值,判断宫颈鳞状上皮内病变的特异性为67.1%、敏感性为85.5%;但若以3.155 0为阈值,那么特异性将上升至73.9%、敏感性为82.2%;若以5.965 0为阳性阈值,判断HSIL的敏感性上升至92.0%,特异性也上升至68.8%。但如果继续以1.0为阳性阈值,判断HSIL的敏感性虽然可以上升为96.0%,但特异性则下降至60.0%。由此可以看出,适当地提升高危型HPV DNA的阳性阈值,可在敏感性没有受到大幅度下降的前提下,提高其检测的特异性[ 5]。本研究结果与冯燕等[ 5]、肖克林等[ 8]的报道相似,都可以通过提升检测阈值来使检测效能达到最佳。但本研究的检测阈值与文献报道[ 5, 8]稍有差异,这可能与研究时病例收集方式与来源不同有关。此外,由于本研究采用的HC2方法中高危型与低危型HPV存在着一定的交叉反应[ 9],从而有可能导致假阳性率的上升。因此,在面对不同程度的宫颈癌前病变,灵活机动地运用阈值的变化,不仅能够降低由于阈值过低而产生的假阳性,也能大大减少由于假阳性的诊断结果而引发的一系列不必要或重复的医疗检查[ 6]。由于宫颈癌前病变可存在多年,而且子宫颈具有有利的解剖学基础,易于暴露,便于观察、触诊及取材,如能在宫颈癌前病变阶段被确诊,即可进行进一步治疗或监测,降低宫颈浸润癌的发病率和死亡率。

综上所述,高危型HPV DNA负荷量的变化先于病理学的改变。当HPV感染一段时间后,细胞学和组织学才会发生变化[ 7],所以HPV DNA检测具有一定的前瞻性,对于早期的宫颈疾病的筛查具有重要的临床意义。

(收稿日期:2013-12-09)

(本文编辑:龚晓霖)

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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