结核分枝杆菌培养是诊断结核病的金标准。但结核分枝杆菌生长周期长,生长缓慢,标本前处理过程多且复杂,因而易受标本本身和外界细菌的污染,尤其是液体分枝杆菌培养管( Mycobacterium grow indicate tube,MGIT)由于培养基成分和环境等因素,污染率较改良罗氏培养基L-J法高^{[ 1]}。为此,我们就手工MGIT液体培养污染及去污染再处理效果与固体L-J培养污染率进行分析比较。

一、标本来源

收集2010年11月至2011年10月上海市松江区中心医院及上海市第七人民医院肺结核门诊和住院的1 088例疑似新发肺结核初诊患者痰标本。结核病诊断标准参见卫生部WS288-2008《肺结核诊断标准》^{[ 2]}。

二、仪器与试剂

抗酸染液为珠海BASO公司生产,固体L-J培养基为上海奥普生物工程有限公司生产,液体MGIT培养基及MicroMGIT荧光判读仪为美国BD公司生产,5810型离心机为德国Eppendorf公司生产。以上试剂和仪器均由上海市疾病预防控制中心统一提供。

三、方法

1.痰标本留取 参照文献[3] 嘱患者留晨、晚间痰和即时痰3次,每份直接涂片1张进行抗酸染色,涂片染色操作方法参照《结核病诊断实验室检验规程》^{[ 3]},涂片统计阴阳性时以每位患者3次送检痰标本有1次阳性即统计为阳性,培养时将3次痰标本混合成1份进行前处理,以提高培养集菌的阳性率。

2.标本前处理 L-J法、MGIT培养标本前处理和MGIT法污染后再处理及结果判断参照试剂说明书和文献报道^{[ 4, 5, 6]}进行。如发现首次MGIT培养有污染,即可将污染的MGIT培养管内容物置于50 mL带盖的尖底离心管中,同时加5 mL N-乙酰-L-半胱氨酸-NaOH(NaOH-NALC)前处理液震荡5~20 s,静置消化15~20 min,加入磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS;pH值6.8)至50 mL,3 000× g离心15 min再弃上清,沉淀用0.5 mL PBS(pH值6.8)制备成悬浊液,取0.5 mL接种MGIT培养管中。在标本接种MGIT前,在每一个MGIT试管中加入0.5 mL OADC(营养添加剂)和0.1 mL 以无菌蒸馏水溶解的PANTA(杂菌抑制剂),置37 °C培养箱内培养,次日起开始观察菌生长情况。

3.分离培养 液体培养用手工MGIT荧光读数仪从培养次日开始进行判读,L-J法早、晚2次观察菌落生长情况。2种方法所有阴性培养管继续进行培养和判读至8周。MGIT阴性培养管应在丢弃前再次观察管内的混浊或小颗粒的情况,检测出的阳性培养均涂片抗酸染色确认。

4.污染方法的确认 液体MGIT混浊时或固体L-J培养基上有菌落生长时分别涂片做抗酸染色和革兰染色。镜检为非抗酸杆菌则判断为污染。

5.质量控制 涂片染色每周用上海市临床检验中心抗酸染色阴阳性片作平行检测合格,室间质评定期随机涂片抽样送上海市疾病预防控制中心参加盲法复检评估各项指标合格。L-J法和MGIT法所有阳性培养样本均送上海市疾病预防控制中心结核病防治科确认为结核分枝杆菌复合群。

四、统计学方法

采用PEMS 3.1医学统计软件包进行污染率的 χ²检验。 P<0.05为差异有统计学意义。

1 088份培养痰标本中,MGIT首次总污染率为7.90%(86/1 088),MGIT法去污染后再次培养总污染率为4.04%(44/1 088);L-J法总污染率为3.68%(40/1 088),经 χ²检验,MGIT法的首次总污染率高于L-J法( P<0.05);去污染后再培养总污染率与L-J法间比较,差异无统计学意义( P>0.05)。涂片阳性(简称涂阳)组169例,MGIT法首次污染率为11.24%,涂片阴性(简称涂阴)组919例,MGIT法首次污染率为7.29%,均高于L-J法涂阳组(2.96%; χ²=10.88, P=0.001)和涂阴组(3.80%; χ²=11.96, P=0.008)。涂阳组MGIT法去污染后再培养的污染率为0.59%,低于L-J法污染率,但差异无统计学意义( χ²=2.66, P=0.22)。涂阴组MGIT法去污染后再培养污染率为4.68%,高于L-J法,但差异无统计学意义( χ²=0.91, P=0.34)。在涂阳组和涂阴组之间,MGIT法首次污染率差异无统计学意义( χ²=3.06, P=0.08);L-J法涂阳组和涂阴组的污染率差异无统计学意义( χ²=0.29, P=0.59),但去污染后再培养涂阳组和涂阴组污染率差异有统计学意义( χ²=6.15, P=0.013)。MGIT首次污染共86例,标本去污染后再培养有22例阳性、20例阴性、44例污染。见表1。

表1

表1

表1 1 088份痰标本MGIT法和L-J法污染率比较 抗酸染色 例数 MGIT法首次污染(%) MGIT法去污染后再培养 L-J法污染(%) (+) (-) 污染(%) 涂阳组 169 19(11.24) 17 1 1(0.59) 5(2.96)* 涂阴组 919 67(7.29) 5 9 43(4.68)# 35(3.80)* 合计 1 088 86(7.90) 22 10 44(4.04) 40(3.68)* 注:与MGIT法首次污染率比较,* P<0.05;与涂阳组比较,# P<0.05

表1 1 088份痰标本MGIT法和L-J法污染率比较

结核病早期诊断中结核分枝杆菌培养阳性起着确诊作用。手工MGIT液体培养管比固体L-J法报阳时间明显缩短,同时阳性率也明显提高^{[ 4, 5, 6, 7]},且不需昂贵设备,操作简便,可在基层实验室进行。结核分枝杆菌痰培养污染菌多为普通细菌,其来源可能有3个方面:(1)前处理过程中带入的污染杂菌;(2)口腔中污染的杂菌;(3)引起肺部感染的其他细菌^{[ 7, 8]}。污染菌比结核分枝杆菌的生长周期短,繁殖快,其新陈代谢产物直接改变结核分枝杆菌生长的微环境而抑制其生长,故应对标本中的污染菌进行预处理,减少污染率,提高结核分枝杆菌的阳性检出率。国外文献曾报道MGIT液体培养污染率为9.7%^{[ 5]},国内李静等^{[ 6]}报道为3.0%,本研究的污染率为7.90%。

由于污染的普通细菌生长周期短,繁殖快,在1周内观察到混浊即可发现,故液体MGIT法可通过处理去污染后再培养,发现的污染越早,再处理越及时,去污染再培养报阳时间就越早,而固体L-J培养就很难重处理后进行2次培养。

从本研究结果来看,液体MGIT法无论是涂阳、涂阴标本还是总污染率在首次培养时比固体L-J法的污染率均高( P<0.05),其首次液体MGIT法培养污染率达到7.90%,超过控制目标(2%~5%)^{[ 3]}。分析推测首次污染高的原因是前处理时受痰液黏性强、消化振荡不彻底、所含的杂菌量多或抗抑制剂强、前处理液的量不能很好控制等因素,导致杂菌不能完全抑制;而液体MGIT法去污染后再处理污染率明显下降,为4.04%,与固体L-J法的污染率差异无统计学意义( P>0.05)。再次处理后,体外MGIT中培养生长的杂菌能得以抑制。而对2种培养基双重污染推测是有些污染的杂菌可能是对前处理、MGIT和L-J中的抑菌剂都不敏感所致。从本研究结果可以看出,两种方法双重污染杂菌多为涂阴标本,而这部分患者可能是肺部感染带有耐药性的其他类非结核分枝杆菌所致,提示MGIT法在控制污染率上能达到标准的要求。

MGIT法和L-J法两种方法控制污染源头应从3个方面着手:(1)加大无菌操作的力度,如在生物安全柜中进行操作或负压高净化下实验室内进行操作,所有使用物品高压灭菌后使用;(2)增加PANTA的浓度或用量,特别是涂阴标本应调整前处理的消化时间或 PANTA浓度,但又不能过度和过量,必须控制首次MGIT法的污染率在2%~5%之间,这样大大减少首次污染的同时又保证阳性率^{[ 9]};(3)同时要高度重视对肺部感染的控制和口腔杂菌污染,是控制污染率非常重要的一个环节。本研究在涂阴和涂阳组间液体培养法去污染后再培养污染率差异有统计学意义( P<0.05)。需要说明的是本研究所收集的部分痰标本阴性的患者多是肺部其他细菌感染并需排除结核感染或可能是肺结核合并其他细菌感染,因痰标本中有其他细菌存在,在行结核分枝杆菌培养时会引起污染。因此,对于这些患者,临床医生可在控制其他细菌感染后再留标本做结核分枝杆菌培养。以上措施同样适用于避免固体L-J培养的污染。值得一提的是对抗酸染色涂阳的MGIT法污染的19份标本中,再次处理后17例培养仍是阳性,只有1例培养阴性和1例培养仍是污染,避免了L-J法培养污染后患者需再次送检标本而延误结核病诊断和治疗。

(收稿日期:2013-06-03)

(本文编辑:姜 敏)