强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是一种以骶髂关节为首发部位,慢性炎症逐渐累及骶髂关节、脊柱、软骨组织及四肢关节为主要表现的全身性的自身免疫性疾病,病因与发病机制迄今未明^{[ 1]},主要危害青壮年,尤以男性居多。男性患者呈现发病症状重、进展快等特点,病情严重患者极易致畸、致残并丧失生活自理能力。

AS发病机制目前还不清楚。近年来有多种假说^{[ 2]}被提出。自身免疫病发生、发展和预后的中心环节是免疫系统异常。关于自身耐受破坏的机制至今尚无统一的认识。目前已有文献报道T细胞亚群失衡、细胞因子异常在AS的发生、发展中起关键作用^{[ 3]}。CD4⁺T淋巴细胞亚群可分为辅助性T细胞1(T helper cells 1,Th1)、辅助性T细胞2(T helper cells 2,Th2)和辅助性T细胞17(T helper cells 17,Th17),主要发挥调节功能。目前Th1、Th2、Th17细胞未发现有特异性的细胞表面标志,因此只能通过其功能鉴别,即鉴别体外刺激后分泌的细胞因子的种类,如γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)、白细胞介素(interleukin,IL)-4、IL-17。我们通过检测AS患者外周血中CD4⁺T淋巴细胞亚群Th1(CD3⁺CD8^-INF-γ⁺)、Th2(CD3⁺CD8^-IL-4⁺)、Th17(CD3⁺CD8^-IL-17⁺),分析其与AS活动性的相关性,初步探讨CD4⁺T淋巴细胞亚群及其胞内细胞因子在AS发生、发展中可能的机制,以期全面了解AS的免疫功能状态,为AS的临床诊断及治疗提供新思路和新方法。

一、对象

选择贵阳医学院附属医院AS患者78例,包括未曾用药治疗的初诊患者以及曾诊断为其他疾病且近期未接受临床药物治疗患者。其中男65例,女13例,年龄17~53岁。AS诊断均符合1984年纽约修订标准^{[ 4]}。所有患者HLA-B27均为阳性,既往无免疫相关性疾病,无人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染,无病毒性肝炎,无免疫抑制类药物治疗史,肝、肾功能正常,同时排除合并其他类型自身免疫性疾病(如类风湿关节炎等)。标本采集前均征得研究对象同意并自愿签署知情同意书。所有AS受试者均在实验人员指导下填写病例调查表以及Bath AS功能指数(bath ankylosing spondylitis function index,BASFI)、Bath AS病情活动指数(bath ankylosing spondylitis disease activity index,BASDAI)表格。依据BASDAI,将AS组分为高活动性AS组(BASDAI≥4分,34例)、低活动性AS组(BASDAI<4分,44例)。AS两组间年龄及性别构成差异无统计学意义( P>0.815)。选取同期贵阳医学院附属医院体检中心健康体检者30名作为正常对照组,其中男16名、女14名,年龄15~52岁,无HIV感染,无病毒性肝炎及自身免疫性疾病史,血压、心肺功能、血生化、肝功能、肾功能、尿检均正常。AS组与正常对照组之间性别构成及年龄差异无统计学意义( P=0.773)。

二、试剂与仪器

1.主要试剂 硫氰酸荧光素(FITC)-抗人CD3抗体、藻红蛋白花青苷7(PECy7)-抗人CD8抗体、别藻蓝蛋白(APC)-抗人IFN-γ抗体、藻红蛋白(PE)-抗人IL-4抗体、PE-抗人IL-17抗体、人类白细胞抗原-B27检测试剂盒(HLA-B27 Kit)、PE-抗人CD69抗体、Treg Cocktail、PECy7-抗人IgG1抗体、PE-抗人IgG1抗体、APC-抗人IgG2a抗体、流式细胞仪7色校准微球(BD FACS 7-Color Setup Beads)、细胞内细胞因子检测破膜固定剂perm2、红细胞裂解液/溶血素、磷酸盐缓冲液(PBS)均购自美国BD公司,离子霉素(Ionomycin)、佛波酯(PMA)、莫能霉素(Monensin)购自美国Sigma公司,胎牛血清购自美国Hyclone公司,二甲基亚砜购自天津市富宇精细化工有限公司,RPMI 1640 液体培养基购自美国Lonza Bio Whittaker公司。

2.仪器 FACS CantoⅡ流式细胞仪(美国BD公司),Thermo Scientific Forma 二氧化碳培养箱(美国Forma公司),SYM-BIO EGATA2310全自动洗板机(上海新波生物技术有限公司)、SYM-BIO 2510 酶标板振荡器(上海新波生物技术有限公司),Well Scan K3 酶标仪(芬兰雷勃公司),台式离心机、37 ℃电热恒温水浴箱、超净工作台、微型漩涡混合器。

三、方法

1.标本采集 采用EDTA-K₂抗凝管采集所有对象晨起空腹静脉血2~3 mL,2 h内采用流式细胞术(flow cytometry ,FCM)检测外周血Th1、Th2、Th17细胞。

2.细胞体外刺激活化 取外周血500 μL,加入487 μL含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基混合,同时加入佛波酯、莫能霉素和离子霉素,使终浓度分别为50 ng/mL、1 μg/mL和7 μg/mL。置于37 ℃、5%CO₂细胞培养箱刺激培养5 h。

3.CD69的检测 细胞体外刺激活化后首先通过检测CD3⁺CD8^-T淋巴细胞膜表面的CD69表达,监测评价激活是否达到期望水平。当CD69表达>90%即可继续进行Th1、Th2、Th17细胞的检测。

4.Th1、Th2、Th17细胞检测样品制备 采用FCM检测Th1(CD3⁺CD8^-IFN-γ⁺)、Th2(CD3⁺CD8^-IL-4⁺)、Th17(CD3⁺CD8^-IL-17⁺)细胞的百分率。胞内因子标记主要包括细胞表面抗原标记、细胞固定和破膜、细胞内因子标记。取3支试管,分别标记并加入CD3-FITC、CD8-PECy7抗体各20 μL,分别加入已刺激培养5 h的全血50 μL,用漩涡混合器充分混匀,室温避光孵育15 min;加入溶血素800 μL,充分混匀避光溶血3 min,再转入37 ℃水浴箱中孵育5 min,加入PBS 1 mL,充分混匀后1 000× g离心5 min,弃上清,重复1次。加入提前双蒸水10倍稀释的破膜剂1 mL,用漩涡混合器混匀,室温避光孵育15 min破膜,1 000× g离心5 min,弃上清,加入对应抗体标记同型对照(-)、Th1/Th2(+)、Th17(+),用漩涡混合器混匀,室温避光孵育15 min;加入PBS 1 mL,充分混匀,1 000× g离心5 min,弃上清,重复1次;弃上清液,加入适量PBS充分混匀,上机检测。打开FACS Diva软件,将标本置于上样盘中依次收集标本,同时设空白、同型对照,每例收集1×10⁴个细胞。Th1、Th2、Th17细胞FCM设门方法见图1。在前向角散射(FSC)-侧向角散射(SSC)散点图中圈定淋巴细胞群,再分析门内CD3⁺CD8^-和CD3⁺CD8⁺细胞群,此时CD3⁺CD8^-细胞即为CD4⁺细胞,再分别分析IFN-γ、IL-4、IL-17细胞的表达。Th1、Th2、Th17细胞的结果分别以CD3⁺CD8^-IFN-γ⁺、CD3⁺CD8^-IL-4⁺、CD3⁺CD8^-IL-17⁺细胞的百分率表示。

图1

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图1 FCM检测Th1、Th2、Th17细胞的设门方法

四、统计学分析

采用SPSS 18.0软件进行统计分析。检测数据采用x- ±s表示。组间比较采用 t检验计分;两变量之间的相关性采用Pearson相关分析方法,| r|>0.7 为存在高度相关,0.4≤| r|<0.7为中度相关,| r|<0.4 为低度相关。 P<0.05为差异有统计学意义。

一、不同活动性AS患者外周血Th1、Th2、Th17细胞

AS组、低活动性AS组及高活动性AS组外周血Th1细胞比例均明显高于正常对照组( P均<0.01);且高活动性AS组明显高于低活动性AS组( P<0.01)。AS组及高活动性AS组外周血Th2细胞比例均明显低于低活动性AS组和正常对照组( P均<0.05);且高活动性AS组明显低于低活动性AS组( P<0.01);而低活动性AS组与正常对照组比较差异无统计学意义( P>0.05)。AS组、低活动性AS组和高活动性AS组外周血Th17细胞比例均明显高于正常对照组( P<0.05);且高活动性AS组明显高于低活动性AS组( P<0.01)。见表1、图2。

表1

表1

表1 AS组及正常对照外周血Th1、Th2、Th17细胞比例比较 (x- ±s,%) 组别 例数 Th1细胞 Th2细胞 Th17细胞 正常对照组 30 12.05±1.78 1.98±0.60 0.82±0.35 AS组 78 15.86±3.30** 1.51±0.51* 1.57±0.78** 低活动性AS组 44 14.18±2.35** 1.90±0.51 1.26±0.57** 高活动性AS组 34 17.75±3.14**# 1.31±0.41**# 2.00±0.86**# 注:与正常对照组比较,* P<0.05、** P<0.01;与低活动性AS组比较,# P<0.01

表1 AS组及正常对照外周血Th1、Th2、Th17细胞比例比较 (x- ±s,%)

图2

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图2 FCM检测Th1、Th2、Th17细胞

二、 AS患者外周血Th1、Th2、Th17细胞与AS活动性的相关性分析

将AS患者外周血Th1、Th2、Th17细胞分别与BASDAI做相关性分析。AS患者外周血Th1细胞、Th17细胞与BASDAI呈正相关[相关系数( r)分别为0.809、0.409, P均<0.01],Th2细胞与BASDAI呈负相关( r=-0.340, P<0.01)。

表2

表2

表2 AS患者外周血Th1、Th2、Th17细胞与BASDAI的相关性分析 统计值 Th1细胞 Th2细胞 Th17细胞 r值 0.809 -0.340 0.409 P值 0.000 0.002 0.000

表2 AS患者外周血Th1、Th2、Th17细胞与BASDAI的相关性分析

AS是一种严重的慢性炎性风湿性疾病,与HLA-B27密切相关,其主要涉及的轴向骨骼和骶髂关节,也会影响周围关节和肌腱端,被认为与遗传、环境、感染相关^{[ 5]}。随着免疫学动物模型建立及分子生物学技术的发展,已发现免疫功能紊乱在AS这类自身免疫性疾病的发病机制中有重要作用,如AS患者体内存在B淋巴细胞亚群^{[ 6]}、CD4⁺T淋巴细胞异常^{[ 7]}。CD4⁺T淋巴细胞经刺激后可根据其功能不同分为辅助性T细胞及调节性T细胞,在疾病及系列因素刺激下依赖体内微环境中不同细胞因子诱导分化为不同职能的细胞亚群。Th细胞前体在抗原刺激下分化为中间阶段的Th0细胞,Th0细胞在IL-12、IFN-γ的诱导下分化为Th1细胞,在IL-4的诱导下分化为Th2细胞。静息T细胞在IL-6、转化生长因子-β(transfroming growth factor-β, TGF-β)(同时缺乏IL-4、IL-12)的诱导分化为Th17细胞,在TGF-β、IL-10的诱导下分化为Treg细胞。CD4⁺T淋巴细胞亚群通过产生细胞因子和趋化因子协调机体完成完整的免疫反应^{[ 8, 9]}。

Th1细胞主要分泌IFN-γ、IL-2、IL-18和TNF-β等细胞因子,主要效应是介导细胞免疫。Th1细胞的异常激活在多数器官特异性自身免疫性疾病中是具有提示作用的关键事件,被认为参与了慢性炎症性自身免疫疾病引发的组织破坏。本研究结果显示,AS患者Th1细胞增高,这与Nurieva等^{[ 10]}对AS患者Th1、Th2细胞的研究结果一致。本研究还发现,患者外周血Th1细胞与BASDAI呈明显正相关( r=0.809, P<0.01)。低活动性AS组(即AS早期)就出现Th1细胞数量的异常增高,且随AS活动性的增高,Th1细胞异常增高的趋势更为明显。由此表明AS是一类由Th1细胞亚群驱动的疾病,且与疾病活动性高度相关。

Th2细胞主要分泌细胞因子IL-4、IL-5、IL-6和IL-10。Th2细胞分泌的IL-4是重要的抑制炎症因子,在体内发挥抗炎作用,可促进B细胞活化和诱导B细胞合成免疫球蛋白(Ig)E,在Ig类别转化中发挥调节作用,增强B细胞介导的体液免疫应答。本研究结果显示,AS患者Th2细胞降低,且与AS活动性呈负相关( r=-0.340, P<0.01)。故外周血Th2细胞可作为AS疾病活动性的指标。低活动性AS组外周血Th2细胞稍降低,但与正常对照组比较差异无统计学意义( P>0.05);随着疾病的进展,高活动性AS组Th2细胞明显低于正常对照组( P<0.01)。提示Th2细胞的抑制炎症作用在AS早期所起的作用比较有限,而AS晚期Th2细胞的大幅度降低可能与Th1细胞增高有关。Th1细胞和Th2细胞产生的细胞因子间存在交叉调节作用。Th1细胞分泌的IFN-γ可抑制Th2细胞分化增殖。AS组Th1细胞增高,由Th1细胞分泌的细胞因子作用增强^{[ 11]}。本研究中AS患者Th细胞以Th1细胞介导的炎症反应为主导,Th1细胞过强导致Th2细胞负调节作用减弱,炎性细胞因子产生过多,抗炎介质缺乏,最终导致Th1/Th2细胞失衡。由此可见,在AS疾病进展过程中存在着Th1细胞逐渐增高、Th2细胞逐渐减少的趋势,Th1/Th2细胞失衡逐步放大。

Th17细胞在2005年被发现,是以分泌IL-17(一般指IL-17A)为主要特征的T细胞亚群,因此被命名为Th17或产IL-17 T细胞^{[ 12]}。Th17细胞主要是通过分泌促炎细胞因子IL-17,确保中性粒细胞分化、成熟和活化,刺激单核细胞和成纤维细胞活化来参与AS炎症反应^{[ 13]}。本研究中AS患者外周血Th17细胞与AS活动性呈正相关( r=0.409, P<0.01)。但低活动性AS组Th17细胞增高并不明显,高活动性AS组Th17细胞则明显增高。提示Th17细胞主要介导AS活动期的炎症反应,并参与疾病的进展。Th17分泌的促炎细胞因子IL-17可通过刺激滑膜成纤维细胞分泌基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-1、与IL-1β和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)协同诱导核因子κB受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor-kappa B ligand, RANKL)及其受体核因子κB受体活化因子(receptor activator of nuclear factor-kappa B, RANK)的活化等途径参与关节的骨质破坏及周围组织的炎性损伤,尤其是在AS后期参与了疾病的进展。

AS晚期的软骨和骨破坏病理改变难以修复,导致脊柱或外周关节骨性强直、畸形,甚至致残。合理治疗、控制和逆转软组织炎症是AS治疗关键^{[ 14]}。本研究结果显示,AS患者体内存在CD4⁺T淋巴细胞亚群细胞数量及功能的失衡。发挥抗炎效应的Th2细胞数量减少,发挥促炎作用的Th1、Th17细胞增加,打破了维持免疫稳态的转化平衡,从而引起免疫应答异常^{[ 15]}。Th1、Th2、Th17细胞在人体内构成了复杂的调节网络。在多种自身免疫性疾病中,Th细胞亚群异常结果^{[ 16]}基本一致。纠正细胞失衡、调节其功能是治疗AS的可能策略,能达到诱导病情缓解、减轻关节炎症反应的作用。Th细胞功能失衡进而导致AS的发生、发展,故可通过检测CD4⁺T淋巴细胞亚群监测AS患者的治疗及疾病活动情况。AS的病程发展是慢性的临床经过,目前尚无成熟的早期诊断标准。临床诊断主要是根据患者体征、症状和骶髂关节医学影像学检查。AS初诊患者标本难收集、易误诊。本研究标本收集中将曾诊断为其他疾病,后经临床检测诊断为AS且未接受AS临床药物治疗的这一部分患者也纳入AS组范围。本研究的不足之处是未对经系统治疗后的AS患者做对比研究,此项工作有待今后进一步深入。

综上所述,CD4⁺T淋巴细胞亚群之间及所产生的细胞因子网络的平衡是调节体内细胞免疫和体液免疫的重要枢纽。AS患者存在CD4⁺T淋巴细胞网络机制紊乱。随着AS疾病活动性的增强,患者体内Th1、Th17细胞介导的细胞免疫功能亢进,而Th2细胞介导的免疫抑制作用减弱。联合检测AS患者外周血Th1、Th2、Th17细胞有助于AS病程监测、提示预后,对AS的临床治疗有重要意义。因此,Th1、Th2、Th17细胞有望成为临床判断AS病情和预后的有效指标。