糖尿病足(diabetic foot,DF)是糖尿病最严重和治疗费用最高的慢性并发症之一,约25%的糖尿病患者会发生足溃疡^{[ 1]}。DF的发病机制主要包括外周神经病变、血管病变和感染三个方面。创面迁延难愈与DF患者的不同炎症状态有关。血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)、成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor 2,FGF2)等炎症因子与抗炎因子之间的浓度平衡是DF炎症病理调节的机制^{[ 2]}。但DF发病机制中各炎症因子的相互影响尚未阐明。炎症因子对病程迁延,甚至发生截肢的难愈性DF患者风险预测和预后判断未见报道。我们通过比较难愈性DF患者与2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者的血清炎症因子水平,探讨它们与难愈性DF的相关性,为预防DF的发生提供依据。

一、研究对象

选择2012年12月至2013年7月期间在上海市中西医结合医院脉管科住院的DF患者145例(DF组),男90例,女55例,年龄32~90岁;筛选同期就诊的无足部溃疡的T2DM患者65例作为对照(T2DM组),男35例,女30例,年龄29~89岁。糖尿病诊断标准参照美国糖尿病协会2012年发布的《糖尿病诊疗标准(2012版)》。DF的诊断标准参照2011年国际DF工作组(IWGDF)发布的《糖尿病足国际临床指南》^{[ 3]}。DF的分级参照Wagner分级方法^{[ 4]}。

二、病例纳入、排除标准

纳入标准:(1)符合以上诊断标准;(2)糖尿病足部溃疡反复发作至足部坏疽,Wagner分级Ⅲ级以上,病程迁延,经久不愈者。

排除标准:(1)不符合上述纳入标准;(2)近半年内急性心肌梗死发作、脑梗塞或脑出血者;(3)合并有严重肝、肾功能不全、血液病、恶性肿瘤等疾病以及精神病患者;(4)存在其他感染性疾病者;(5)不配合治疗者及临床资料不全者。样本采集过程符合伦理学要求,所有入选病例患者均已签署知情同意书。

三、方法

1.临床资料采集 入院后采集患者的一般资料,包括年龄、性别、糖尿病病程、心率和体重指数(body mass index,BMI)等内容。

2.实验室指标测定 所有样本均为患者入院后已确诊为DF和T2DM,在首次检查时(空腹12 h后)采集。VCAM-1、FGF2和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定,试剂盒购自美国R&D Systems公司,酶标仪为Multiskan MK3酶标仪(Thermo公司);白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)采用电化学发光法,使用Cobas e601电化学发光免疫分析仪及配套试剂(Roche公司)检测。血糖(fasting blood glucose,FBG)、餐后2 h血糖(2 hour postprandial blood glucose,2 hPG)使用Roche公司试剂,糖化白蛋白(glycated albumin,GA)使用日本旭化成制药株式会社公司试剂,均在HITACHI 7600-020全自动生化分析仪(日本日立公司)上分别采用酶比色法和免疫比浊法检测;糖化血红蛋白(glycated hemoglobin A_1c,HbA_1c)和C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)分别采用D-10糖化血红蛋白分析仪(Bio-Rad公司)、BNP ProSpec特定蛋白分析仪(德国德灵公司)及配套试剂检测。白细胞计数(white blood cell count,WBC)和中性粒细胞比率(neutrophil ratio,Neu%)采用XE-2100全自动血液分析仪及配套试剂检测(日本Sysmex公司);纤维蛋白原(fibrinogen,FIB)在CAl500全自动血凝仪(日本Sysmex公司)上使用Dade Behring公司试剂检测。所有操作均严格依据试剂说明书进行。

四、统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计分析。符合正态分布且方差齐的计量资料以x- ±s表示,统计学分析采用两独立样本 t检验,计数资料采用 χ²检验;不符合正态分布或方差不齐的资料以中位数(范围)表示,统计学分析采用Mann-Whitney U检验;相关分析采用Pearson相关分析;多组间比较采用方差分析;风险因素分析采用二元Logistic回归分析。 P<0.05为差异有统计学意义。

一、DF组和T2DM组基线指标比较

DF组年龄、糖尿病病程、心率均高于T2DM组( P<0.01),而性别构成、BMI和FBG等反映糖代谢及血糖控制状况的指标差异均无统计学意义( P>0.05)。见表1。

表1

表1

表1 DF组和T2DM组基线指标比较 (x- ±s) 组别 例数 年龄(岁) 糖尿病病程(年) 心率(次/min) BMI(kg/m2) T2DM组 65 63±11 9.79±7.74 78±6 24.82±3.45 DF组 145 70±12* 15.85±9.49* 82±8* 23.83±3.48 组别 例数 FBG(mmol/L) 2 hPG(mmol/L) HbA1c(%) GA(%) T2DM组 65 8.55±3.83 14.58±4.78 8.97±2.40 21.50±8.57 DF组 145 8.83±4.22 13.34±5.04 9.05±2.09 24.94±17.28 注:与T2DM组比较,* P<0.01

表1 DF组和T2DM组基线指标比较 (x- ±s)

二、DF组和T2DM组炎症指标比较

和T2DM组相比,DF组VCAM-1、FGF2、TNF-α、IL-6、WBC、Neu%、FIB和CRP水平明显升高( P<0.01)。TNF-α与VCAM-1呈正相关[相关系数( r)=0.284, P=0.000]。见表2。

表2

表2

表2 DF组和T2DM组炎症指标结果比较 (x- ±s) 组别 例数 VCAM-1(ng/mL) FGF2(pg/mL) TNF-α(pg/mL) IL-6(pg/mL) T2DM组 65 719.69±201.62 12.26±4.71 16.08±7.15 4.80(1.50~12.10) DF组 145 1 145.05±432.22* 17.69±8.13* 21.77±12.65* 20.50(1.88~252.50)* 组别 例数 CRP(mg/L) FIB(g/L) WBC(×109/L) Neu(%) T2DM组 65 3.00(0.29~17.00) 2.82±0.73 6.36±1.58 57.39±9.16 DF组 145 15.00(0.29~244.00)* 4.47±1.12* 8.56±3.84* 71.08±9.89* 注:与T2DM组比较,* P<0.01

表2 DF组和T2DM组炎症指标结果比较 (x- ±s)

三、风险因素回归分析

1. 单因素Logistic回归分析 以临床诊断为应变量,两组间有明显差异的指标为自变量,进行单因素Logistic回归分析。结果表明VCAM-1、FGF2、TNF-α、IL-6、年龄、糖尿病病程、心率、WBC、Neu%、FIB和CRP是DF发生的危险因素。见表3。

表3

表3

表3 DF组与T2DM组单因素分析比较 指标 P值 OR值 95%可信区间( CI) 下限~上限 VCAM-1 0.000 1.006 1.004~1.008 FGF2 0.000 1.179 1.099~1.264 TNF-α 0.001 1.093 1.036~1.154 IL-6 0.000 1.363 1.164~1.595 年龄 0.000 1.052 1.025~1.079 糖尿病病程 0.000 1.086 1.044~1.130 心率 0.002 1.070 1.026~1.116 WBC 0.000 1.434 1.217~1.689 Neu% 0.000 1.156 1.108~1.207 FIB 0.000 5.353 3.305~8.670 CRP 0.000 1.274 1.148~1.414

表3 DF组与T2DM组单因素分析比较

2. 多因素Logistic回归分析 多因素Logistic回归分析结果显示VCAM-1、TNF-α、FIB和Neu%为DF发生的独立风险因素。见表4。

表4

表4

表4 DF组与T2DM组多因素分析比较 指标 P值 OR值 95% CI(下限~上限) VCAM-1 0.001 1.008 1.003~1.013 TNF-α 0.033 1.234 1.018~1.496 FIB 0.032 2.528 1.085~5.894 Neu% 0.014 1.132 1.025~1.250

表4 DF组与T2DM组多因素分析比较

四、DF组不同Wagner分级间各指标比较

根据Wagner分级将DF组分为Wagner Ⅲ级(37例,男21例、女16例)、Wagner Ⅳ级(92例,男59例、女33例)和Wagner Ⅴ级(16例,男10例、女6例)。对3组间基线指标和炎症指标进行方差分析。结果显示WagnerⅤ级组年龄低于Wagner Ⅲ级组和Wagner Ⅳ级组( P<0.01),而IL-6、CRP、FIB、WBC、Neu%均高于Wagner Ⅲ级组和Wagner Ⅳ级组( P<0.05、 P<0.01)。WagnerⅤ级组FGF2和HbA_1c高于Wagner Ⅲ级组( P<0.05)。见表5。

表5

表5

表5 DF组不同Wagner分级间各指标比较 Wagner分级 例数 VCAM-1(ng/mL) FGF2(pg/mL) TNF-α(pg/mL) IL-6 (pg/mL) FIB(g/L) Ⅲ级 37 1 158.56±358.24 15.06±9.46 22.14±12.88 12.72(1.88~129.20) 3.98±1.16 Ⅳ级 92 1 108.52±404.62 18.13±7.63 21.71±13.25 21.17(2.77~132.70) 4.55±1.09* Ⅴ级 16 1 323.87±670.38 21.22±5.86* 21.20±8.55 78.20(18.19~252.50)*# 5.19±0.70**# Wagner分级 例数 CRP(mg/L) 年龄(岁) HbA1c(%) WBC(×109/L) Neu(%) Ⅲ级 37 5 (0.29~162.00) 73±11 8.44±2.21 6.61±2.01 68.31±9.24 Ⅳ级 92 18 (1.00~172.00) 71±12 9.13±1.97 8.47±2.63** 70.41±9.27 Ⅴ级 16 104 (12.00~244.00)**## 62±14**## 9.97±2.15* 13.56±7.32**# 81.27±8.94**## 注:与Wagner Ⅲ级比较,* P<0.05、** P<0.01;与Wagner Ⅳ级比较,# P<0.05、## P<0.01

表5 DF组不同Wagner分级间各指标比较

近年来,越来越多的研究表明T2DM是一种长期、慢性低度炎症性疾病^{[ 5]}。多种免疫与炎症因子通过诱导胰岛素抵抗等机制参与T2DM及其血管并发症的病变。Weigelt等^{[ 6]}研究发现DF患者体内存在多种急性时相蛋白与细胞因子的水平上调,且与溃疡大小和感染程度有关,因此探讨炎症因子在DF病变机制中发挥的作用具有重要意义。

血清中高浓度的炎症细胞因子与DF创面难愈相关^{[ 7]}。本研究结果显示,DF患者VCAM-1、FGF2、TNF-α、IL-6等炎症因子水平均明显升高,VCAM-1、TNF-α、Neu%和FIB是DF发生的独立风险因素。由此提示DF患者体内炎症反应扩大。VCAM-1是免疫球蛋白超家族中的一员,参与炎症反应、免疫调节等多种病理、生理过程。正常情况下,机体内非活化内皮细胞仅表达低浓度的VCAM-1。炎症状态下,由于细胞因子和细胞外基质分子的诱导,内皮细胞表达VCAM-1增强^{[ 8]}。但在感染早期,白细胞浸润以中性粒细胞为主,VCAM-1的作用较小。慢性炎症过程中,VCAM-1可与白细胞表面的整合素相结合,导致白细胞黏附于内皮细胞表面,形成栓子阻塞血管。本研究结果显示TNF-α水平与VCAM-1呈正相关( r=0.284, P=0.000)。其机制可能为TNF-α刺激内皮细胞释放可溶性VCAM-1,引起内皮细胞迁移,促进新生血管生成。DF患者血清中高浓度的VCAM-1可作为内皮细胞活化受损的标志。有研究发现,长期高血糖患者体内的晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGEs)与其受体结合后,可激活核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)信号转导途径,诱导VCAM-1的转录与表达上调,增加血管通透性^{[ 9]}。

FGF2是一种由成纤维细胞分泌的生长因子,具有促进组织损伤部位内皮细胞分化和血管新生的能力。临床上外源性FGF2被广泛用于DF的治疗且疗效显著。FGF2通过其促进血管新生能力的作用参与糖尿病视网膜病变过程,其含量下降导致血管生成受损是DF创面难愈的机制之一。本研究结果显示DF组内源性FGF2明显升高,且随着Wagner分级的升高而升高。分析其原因:一方面可能是DF创面愈合的一种保护性反馈机制;另一方面可能是在长期高糖环境下,AGEs 在翻译后水平修饰FGF2形成糖化FGF2,后者丝裂原活性下降,过度激活下游ERK1/2信号转导通路,使细胞凋亡增加,增殖减少;糖化FGF2还可引起内皮细胞功能紊乱,促进血管新生等活性降低^{[ 10]}。

Xu等^{[ 11]}研究发现夏科氏足患者局部炎症反应在强度和时效上的失控导致TNF-α表达增加,引起炎症反应共同下游通路NF-κB配体的表达增加,使破骨细胞成熟,骨质改变。此外,单核巨噬细胞在DF的病变过程也起着重要作用。Uccioli等^{[ 12]}发现足部感染时外周血单核细胞呈特异性前炎症免疫表型,前炎症细胞因子产生增加,抗炎细胞因子分泌减少,共刺激表面分子表达增加。激活的单核细胞和肥大细胞可分泌TNF-α。后者是炎症早期最重要的细胞因子,可通过增加内皮细胞组织因子的合成释放等机制介导炎症反应。同时,TNF-α还可诱导FIB、CRP浓度升高与IL-6、VCAM-1的分泌释放。IL-6与CRP浓度升高可降低机体对胰岛素的敏感性,是预测T2DM发病的危险因子^{[ 13]}。在高糖状态下,IL-6刺激血管内皮因子释放,平滑肌细胞过度增生,增加内皮细胞通透性。此外,IL-6促进肝脏合成血管紧张素原,使血管紧张素Ⅱ浓度升高,后者通过上调NF-κB,促进IL-6、TNF-α和VCAM-1等多种炎症因子水平升高^{[ 13]},形成正反馈。本研究结果显示CRP和IL-6水平随着DF病情严重程度的增加而增高,提示TNF-α激活中性粒细胞释放IL-6,同时循环中的高浓度IL-6和TNF-α刺激肝脏合成CRP,加重内皮损伤^{[ 5]},机体促炎因子水平增高诱导DF创面难愈。DF组不同Wagner分级组间TNF-α水平无明显差异。分析其原因可能是部分患者就诊时急性期已过,体内炎症反应水平有所下降。

FIB作为参与止血与血栓的重要凝血因子,其浓度升高也直接导致血液黏稠度的增加^{[ 14]},改变血流对血管内皮的牵拉和剪切力。这种机械损伤可活化丝裂原激活蛋白激酶JNK和p38,引起细胞应激和炎症反应。同时,FIB及其降解产物可直接激活血管内皮细胞,促进黏附分子表达,引起内皮细胞功能失调。Rattan等^{[ 15]}发现血液中高浓度的FIB可作为预测死亡率和截肢风险的预后标志物。本研究也发现FIB是DF发生的独立风险因素,且WagnerⅣ级和Ⅴ级患者FIB水平明显高于Ⅲ级( P<0.05)。提示在DF病程中监测血FIB水平有助于判断病情进展和指导治疗。

本研究结果表明,DF组和T2DM组的基线情况,如年龄、糖尿病病程及心率对DF发病有重要影响,但心率变化尚未达到疾病诊断水平,意义不大。DF患者存在年龄大、病程长的特征,高龄患者机体细胞免疫能力下降,对治疗的反应也下降,继而加速溃疡恶化。但本研究中WagnerⅤ级患者年龄较低,可能与样本量限制和地区差异等有关。同时,年龄大、病程长对DF患者炎症因子的浓度升高也可能产生影响。血糖水平升高(HbA_1c>9%)是DF愈合及新发溃疡的危险因素,血糖控制差严重影响预后^{[ 16]},本研究结果显示WagnerⅤ级患者HbA_1c水平明显高于Ⅲ级( P<0.05)。表明长期严重高血糖阻碍创面愈合,DF治疗时严格控制血糖水平是根本。

综上所述,血清VCAM-1、FGF2等一系列炎症因子水平升高在DF发生、发展过程中起重要作用。在DF治疗中应注重抗炎治疗,尤其是针对炎症因子信号通路选择特异阻断剂。本研究选择BMI和糖代谢水平基本相同的T2DM患者作为对照,尽量排除糖尿病的复杂发病机制,同时本研究尚存在一定的局限性,由于横断面研究的限制,尚不能对难愈性DF的终点事件发生做出有效的风险评估。