基因敲除技术是研究功能基因作用的重要方法,是在胚胎干细胞技术和同源重组技术基础之上发展起来,可以定向地改变细胞或者生物个体的遗传信息。近年来,基因敲除技术逐渐成熟,成为一种崭新的分子生物学工具。其中Red重组系统、RNA干扰(RNA interference,RNAi)、微小RNA技术和锌指核酸酶技术(zinc-finger nucleases,ZFNs)发展迅速。另外,转录激活子样效应因子核酸酶技术(transcription activator-like effectors nucleases,TALENs)是一种新型的基因敲除方法,其利用TALEs蛋白核酸结合域氨基酸序列与其靶位点核酸序列之间存在着恒定对应关系,从而组装出能特异性结合任意DNA序列的模块化蛋白。TALENs技术操作简便,理论上可以定向修饰任意内源基因序列,被誉为基因敲除技术发展史上新的“里程碑”^{[ 1]}。我们对TALENs技术靶向敲除原理、基本流程、技术应用等作一综述。

TALENs技术作用机制与ZFNs技术类似,它的核心是识别特异DNA 序列的TALEs蛋白和核酸内切酶 FokI。TALEs蛋白^{[ 2]}是黄单胞菌进入植物细胞改变基因序列后转录翻译分泌的,由12个或以上特异性识别DNA序列的串联“蛋白模块”和N-端、C-端两侧序列组成。每个“蛋白模块”由34个氨基酸组成,其中第12、13位点是靶向识别的关键,被称为重复可变的双连氨基酸 (repeat variant di-residue,RVDs)位点^{[ 2]}。TALEs蛋白上的每个RVDs仅能识别1个碱基(A、G、C、T),即 NI识别A、NG识别T、NN识别G或者A、HD识别C(见图1)。这种核酸对应关系由Boch等^{[ 3]}首次提出,之后更多研究^{[ 4, 5]} 证明了这种恒定对应关系。此外Moscou等^{[ 6]}在构建模块时发现NK识别G的特异性比NN好,但NK活性较低,所以更倾向于使用NN^{[ 7]}。由于物种基因组大小的不同,选择的特异序列长度也不同,对于哺乳类动物包括人类细胞的基因修饰,一般选取16~20 bp的DNA序列作为识别靶点。TALEs蛋白是识别靶基因,而 FokI则起了切割DNA的作用。 FokI是一种核酸内切酶,其必须形成二聚体才具有活性,所以大大减少了随机酶切概率。TALEs蛋白和 FokI连接成重组蛋白表达1个重组核酸酶,识别靶位点核酸序列,发挥内切酶活性,切断目的基因,实现基因敲除。

图1

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	图1 TALE模块及对应碱基[ 3]

实际操作中,通常选择目的基因外显子中相隔16~20 bp的2段核酸序列作为靶点,按照核酸序列将相应TALE单元克隆串联起来,获得识别这一特定核酸序列的TALE识别模块。将这2个识别模块(分别)融合克隆到真核表达载体中,此载体含有TALE其它的必需结构域且在C-端融合有 FokI序列。TALEs蛋白与核酸内切酶 FokI偶联后就构建成为剪切特异DNA序列的内切酶TALENs,即TALENs质粒对。

将TALENs质粒对共转入细胞,它表达的融合蛋白可分别与2个靶位点特异结合。此时,2个 FokI临近,形成二聚体,发挥非特异性内切酶活性,在2个靶位点之间切断目的基因DNA双链(见图2)。双链断裂(double-strand breaks,DSB)诱发DNA损伤修复机制,细胞主要通过两种途径来修复:NHEJ(non-homologous end joining)和HDR(homology-directed repair)。前者缺乏修复模板,在此修复修改过程中或多或少地删除或插入了一定数目的碱基,造成移码,形成目标基因敲除突变体^{[ 8]}。除此之外,若提供与断裂位点附近同源的修复模板,细胞可通过后者,利用同源重组方式修复DNA断裂。

图2

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	图2 TALENs技术作用机制[ 10]

TALENs技术介导的同源重组修复与传统基因敲除方法相比,重组效率提高了好几个数量级,并且可对目标DNA 做精细修饰^{[ 9]},如点突变、碱基替换、碱基磷酸化、加入N 端或C端标记等。

TALENs靶向基因敲除技术是一种崭新的分子生物学方法,2011年以来陆续有文献报道其应用于酵母^{[ 11]}、线虫^{[ 12]}、大鼠^{[ 13]}、植物^{[ 14]}、哺乳动物细胞^{[ 15]}等各类研究对象。

Carlson等^{[ 15]}用TALENs技术应用于原代细胞实验,得到高达64%(23/36)的敲除株,克服了传统敲除方法在原代细胞研究操作繁琐、敲除效率低的缺点。大多数应用TALENs技术的研究都采用1对TALENs进行NHEJ修复,Carlson尝试了用2对TALENs作用于同一段长染色体片段,结果显示分别有10%和4%的基因片段产生敲除和倒位。此外,他还用TALENs技术灭活猪基因组中编码低密度脂蛋白(LDL)受体的基因,构建了家族性高胆固醇血症研究模型。

Moore等^{[ 16]}用ZFNs和TALENs技术分别修饰斑马鱼基因组。实验结果显示TALENs技术成功识别所有6个靶位点且都通过PCR检测证实突变,而ZFNs方法只探测到1个位点突变,证实了TALENs具有更高的突变效率。作者还发现TALENs能敲除甲硫氨酸翻译起始位点,这是ZFNs没有的靶基因。研究数据显示TALENs具有与ZFNs相等或更低的细胞毒性(培养3 d细胞死亡数都近似50%)。整个研究提示TALENs方法在斑马鱼基因组突变研究中具有更大的意义,TALENs靶基因敲除技术成功在这些生物体内诱导有效的基因突变也提示它在家畜类生物医学中有潜在的应用前景。

TALENs靶基因敲除技术也同样应用于人类细胞基因功能的研究。Reyon等^{[ 17]}最近的1项大规模实验证实TALENs技术可以敲除人类细胞中任意靶基因DNA序列,而且敲除效率非常高。Stroud等^{[ 18]}采用TALENs技术对编码人类NDUFA9蛋白的基因进行敲除和回复表达实验,证明NDUFA9蛋白在稳定线粒体复合物I的连接中发挥重要功能。Sakuma等^{[ 19]}将每6个蛋白模块连环化来构建TALENs对,提高了核酸酶活性,最终得到1个含有突变的CMV和T7转录启动子的表达载体。能直接应用于动物和胚胎培养细胞转染和mRNA合成,并且从载体构建到哺乳动物细胞突变检测只需要1周,在HEK293T细胞、人类诱导多能干细胞、果蝇和非洲爪蟾中也都有成功基因修饰的案例。

TALENs技术的核酸识别单元与A、G、C、T有恒定的对应关系,成对的识别模块使基因敲除更加精准;没有基因序列、细胞、物种的限制,克服了ZFNs方法不能识别任意目标基因序列以及识别序列易受上下游序列影响等问题,且具有与ZFNs相等或更好的活性;加上该方法毒性低、脱靶情况少,成功率高,已经在植物、细胞、酵母、斑马鱼及大、小鼠等生物体内试验成功,在今后细胞和生物体基因组修饰(包括基因敲除)中将会有更广泛的应用。

TALENs技术引起细胞特异性HDR修复的同时会受到NHEJ竞争性突变的干扰,故对同源重组体的筛选验证是TALENs技术的关键。实验中可采用聚合酶链反应(PCR)扩增法、Southern杂交、正负双向筛选法等。

(一)PCR扩增

TALENs技术过程中,通过在提供同源的修复模板上引入1段特定的引物序列,根据PCR扩增产物的大小就可以筛选同源重组株。Krishnakumar等^{[ 20]} 通过插入MPN607启动子,根据PCR扩增结果筛选得到发生双重同源重组的肺炎支原体敲除株。

(二)Southern杂交

若在同源修复模板上设计1个特异性内切酶位点,随后用特定的限制性内切酶消化转化菌基因组DNA,用敲除载体作为探针,通过Southern杂交,根据同源重组株和非同源重组突变株或者野生菌株的杂交结果的条带大小差异进行区分。

(三)正负双向筛选法

正负双向筛选法是用1个正向选择基因新霉素磷酸转移酶( neo)和1个负向选择基因单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶( HSV-tk),其中 neo插入载体的目的片段中,而 HSV-tk插入目的基因外侧^{[ 21]}。发生重组细菌的 neo基因随基因组复制表达功能,使阳性细胞具有G418抗性,可以在药物选择培养基中得到重组阳性克隆,含有 HSV-tk的重组细胞在培养基中不能存活,经过反复传代会丢失。所以正选择标记可以筛选出发生重组的转化子,负选择标记可以排除发生非同源重组的转化子。

基因敲除技术克服了传统诱变方法的盲目性和偶然性,可以定点、定量地改造生物体基因组结构,修饰后基因会随染色体DNA复制,便于后续研究。近年来TALENs技术以其独特的优势发展迅速,但其应用推广仍然存在一定局限: TALENs技术引起细胞特异性HDR修复的同时,NHEJ竞争性诱变会导致不必要的突变;TALENs技术较ZFNs技术有所提高,但仍没有彻底消除脱靶现象;另外对TALENs或其它编码核酸导入细胞的方法还需要进一步的研究。但相信随着TALENs技术的不断改进,其在基因功能研究中会有更广泛的应用。