胃癌是临床最常见的恶性肿瘤之一,在我国其发病率和死亡率均位居前列^{[ 1]}。2008年上海市流行病学的统计资料显示,胃癌的发病率在男性中居第4位,在女性中位于第3位^{[ 2]}。幽门螺杆菌( helicobacter pylori,Hp)感染是胃癌发生的重要致病因素。Hp感染可引起机体免疫应答,产生炎症介质因子(细胞因子),后者在胃癌的发生中发挥了不可或缺的作用。其中起关键作用的细胞因子有白细胞介素(interleukin,IL)、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、转化生长因子(transforming growth factor,TGF)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)等。

单核苷酸多态性( single nucleotide polymorphism,SNP)也称基因多态性,是普遍存在于生物基因组中的一种新型分子标记,已被广泛应用于胃癌易感性的研究。目前发现许多细胞因子基因多态性与胃癌的发生密切相关,因而也成为人们研究的热点。引起较多关注的细胞因子有细胞核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)、淋巴毒素-α(lymphotoxin-α,LT-α),特别是后者的基因多态性与胃癌易感性的关系是研究的重点。

LT-α,也称TNF-β,是一种炎症介质因子,与TNF-α一样,同属于肿瘤坏死因子超家族的成员。因其具有体外杀伤肿瘤细胞、体内诱导肿瘤出血坏死而得名。编码LT-α的基因—— LTA位于人类染色体6p2.1,是人类主要组织相容性复合体Ⅲ(MHCⅢ)的一部分,其由4个外显子和3个内含子组成,经选择性剪接可产生至少7个亚型^{[ 3, 4]}。LT-α主要由活化的T、B淋巴细胞和NK细胞产生,是一种具有高诱导性、可分泌性的促炎性细胞因子,主要以同二聚体的形式存在,也可与LT-β形成异二聚体。LT-α与TNF-α的细胞来源及氨基酸组成虽有差别,但氨基酸序列有30%同源,且基因结构、染色体定位及生物学活性都极为相似^{[ 5]}。各种刺激因子通过激活有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)途径促进TNF基因的表达,表达产物可与肿瘤坏死因子受体1(tumor necrosis factor receptor 1,TNFR1)或肿瘤坏死因子受体2(tumor necrosis factor receptor 2,TNFR2)结合,与前者结合后可通过激活NF-κB诱导炎性反应,与后者结合可诱导细胞凋亡^{[ 6]}。

TNF对胃癌细胞株SGC7901的增殖有抑制作用。随着TNF作用时间的延长,细胞增殖指数下降。此外,流式细胞实验结果证实其能将细胞阻抑在细胞增殖周期中的G2M期^{[ 7]}。至于LT-α具体的体内抗肿瘤机理还不是很清楚。有研究表明 LTA基因多态性不仅影响其自身的转录活性,也影响其它一些与信号转导、细胞黏附及化学趋化相关的因子的表达,如血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule 1,VCAM-1)、E-选择素和单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)^{[ 8]}。上述分子可诱导NK细胞和单核巨噬细胞到达实体肿瘤组织,并增强细胞的细胞毒作用,也可以增强巨噬细胞和多形核白细胞的抗体依赖细胞介导的细胞毒(antibody-dependent cell-mediatedcytotoxicity,ADCC)作用,诱导干扰素产生,从而发挥一定的抗肿瘤作用^{[ 9]}。

目前,SNP是继限制性片段长度多态性(restricted fragment length polymorphism,RFLP)、微卫星多态性之后的第3代遗传标记。该标记主要是指基因组水平上由单个核苷酸的变异而引起的DNA序列多态性变化,包括单碱基的转换、颠换、插入和缺失。SNP可分成两种形式:一种是在基因编码区,易造成基因功能的突变,导致所编码的各种蛋白质的改变,而蛋白质的改变可能会影响机体的某些生理功能的变化;另一种是在非编码区,存在大量单碱基的变异,可能影响启动子活性而导致蛋白表达水平的异常。随着研究技术的发展,关于基因多态性的研究已从单个等位基因、单体型逐步上升到全基因组水平。其中,与胃癌相关的 LTA基因多态性位点有rs909253(A/G)、rs1041981(C/A)、rs2229094(T/C)、rs746868(G/C)等。

(一) LTA rs909253(A/G)与胃癌易感性的关系

LTA rs909253(A/G),即 LTA +252 A/G,同时也是NCo1 RFLP位点,该位点位于 LTA基因第1个内含子区,体外实验证明该位点的基因多态性影响 LTA的表达^{[ 10]}。有关该位点的研究是近年来研究的热点。研究者们从不同方面,如发病机制、人群差异等研究其与胃癌易感性的关系,少数学者还进行了单体型研究。但是,关于 LTA rs909253(A/G)基因多态性与胃癌遗传易感性关系的研究结果并不一致。

在中国人群中,Li 等^{[ 11]}选取了210例胃十二指肠疾病患者和264名对照进行了病例对照研究,通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)-RFLP发现 LTA+252 A/G杂合子与Hp阳性的非贲门胃癌有关;Fei等^{[ 12]}以湖北人群作为研究对象,发现该地区胃腺癌患者 LTA+252 A/G杂合子的基因型频率显著高于健康人[比值比( OR)=2.08,95%可信区间( CI):1.12~3.86, P=0.020],提示该基因型与胃癌的易感性相关,进一步的研究结果显示其与患者的年龄、性别、分化程度及临床病理分期无关。Guo等^{[ 13]}研究了中国北部上消化道肿瘤高发地区人群,并统计分析多种因素与该基因多态性位点的关系,得到了不同的结果。他们发现该基因多态性位点的基因型和等位基因分布在胃癌患者和健康人群中没有明显差异( P>0.05),吸烟因素不影响 LTA各基因型频率在两组研究人群中的分布差异;但在研究消化道肿瘤家族史的影响时发现与携带 LTA B2/B2基因型的个体相比, LTA B1/B1、LTA B1/B2基因型能显著增加无上消化道肿瘤家族史的胃贲门腺癌患者患病的风险[ OR=2.68(95% CI:1.14~6.29); OR=2.64(95% CI:1.47~4.72)]。这种现象似乎与众所周知的遗传因素影响相悖。此外,研究人员在研究 LTA+252 A/G和 TNF-α+308 G/A 多态性位点的单体型时发现,健康人群中最常见的单体型为1/B2(68.8%),其次为1/B1(25.3%)和2/B1(3.4%); LTA B1/B2 和 TNF-α 1/2 或2/2基因型能显著降低个体患胃贲门腺癌的风险[校正比值比( AOR)=0.37(95% CI:0.15~0.92); AOR=0.34(95% CI:0.13~0.90)]^{[ 13]}。最近一项研究显示, LTA rs909253 G等位基因携带者患胃癌的风险较高,尤其是Hp阳性患者;此外其可能与IL-10共同作用促进胃癌的发生^{[ 14]}。对于中国人群的研究,由于样本量、基因-基因、基因-环境等的限制,研究者未能得出一致性的结论。

Oliveira等^{[ 15]}通过对巴西东南部人群的研究发现胃癌患者和健康人群的 LTA+252 A/G多态性位点的基因型和等位基因频率分布均符合哈代-温伯格平衡,但多元逻辑回归分析(杂合子模型、显性纯合子模型、隐性纯合子模型)结果显示 LTA+252 A/G基因多态性与胃癌发病风险无关( P>0.05)。另外,日本科学家对原子弹爆炸后幸存人群的研究结果显示, LTA+252A/G杂合子基因型是非贲门胃癌的一个独立危险因素[相对危险度( RR)=1.5(95% CI:1.1~2.2), P=0.01],进一步分析还发现 LTA+252 GA和GG基因型是弥散型胃癌的一个危险因素[ RR=2.7(95% CI:1.5~4.8), P<0.001; RR=2.8(95% CI:1.3~6.3), P=0.01]^{[ 16]}。而Meta分析总结出该位点基因多态性可能是亚洲人群患胃癌的一个危险因素,特别是Hp阳性患者^{[ 6, 17]}。

(二) LTA rs1041981(C/A)与胃癌易感性的关系

LTA rs1041981(C/A),即 LTA+804 C/A,位于人类6号染色体第3个外显子处。该位点的多态性会导致密码子26编码的氨基酸由苏氨酸变为天冬酰胺,可能与 LTA高转录活性或高蛋白水平以及细胞黏附分子有关,可通过激活淋巴细胞或直接活化淋巴瘤细胞诱导凋亡^{[ 10, 18]}。研究表明, LTA+804 C/A基因多态性对肿瘤的预后有影响,这可能与该基因的多种功能作用有关,如促进细胞生长和黏附,从而影响某些肿瘤的生长^{[ 19]}。此外, LTA+804 C/A基因多态性与 LTA+252 A/G基因多态性存在极大连锁不平衡关系,而这种关系在 LTA+495 T/C基因多态性中较弱^{[ 9]}。Lee等^{[ 20]}在研究 LTA rs1041981(C/A)与胃癌易感性关系时,入组341例胃癌患者、133例十二指肠溃疡患者及261名健康对照者,对年龄和性别进行校正后通过Logistic分析该基因多态性位点的分布,结果显示该基因多态性与胃癌患病风险无关。目前,关于 LTA+804 C/A基因多态性与肿瘤易感性关系的研究很少。为进一步探讨 LTA+804 C/A基因多态性与胃癌易感性关系以及该位点的细胞学功能,我们正对其进行重点研究。

(三) LTA rs2229094(T/C)与胃癌易感性的关系

LTA rs2229094(T/C),即 LTA+495 T/C,位于 LTA基因的第2个外显子区,T碱基代替C碱基后产生错义突变,使密码子13编码产物由半胱氨酸变为精氨酸。Takei等^{[ 9]}以部分日本老年人(平均年龄80岁)作为研究对象,特别对其中死于恶性肿瘤的患者进行重点研究,采用荧光定量PCR分析 LTA rs2229094(T/C)位点的基因多态性。结果发现男性肿瘤组中TC、CC基因型与肿瘤有一定关联[ AOR=1.45(95% CI:1.04~2.02)],而此现象在女性肿瘤患者中并不明显。进一步分析其与胃癌的关系也发现, LTA SNP位点rs2229094 TC、CC基因型同样能增加男性患胃癌的风险[ AOR=1.68(95% CI:1.06~2.65)],与女性患胃癌风险的关系并不密切。因此,通过对该位点的检测可以间接推测出性别对胃癌的发生似乎有着一定的影响,这可能与男性吸烟、饮食以及接触的环境等多种混杂因素有关。

(四) LTA rs746868(G/C)与胃癌易感性的关系

LTA rs746868(G/C)通常也表述为 LTA AspH1 G/C,与 LTA rs909253(A/G)一样,该位点也位于 LTA基因第1个内含子区,但是关于该位点与胃癌易感性的相关研究较少。有学者在研究欧洲人群 LTA rs746868(G/C)基因多态性与胃癌易感性关系时,选取248例胃癌患者和770名健康者作为研究对象。结果发现, LTA rs746868(G/C)与患者患胃腺癌、胃贲门腺癌、胃非贲门腺癌的风险均无关[ OR=1.03(95% CI:0.76~1.41), P=0.83; OR=0.90(95% CI:0.49~1.65), P=0.74; OR=1.07(95% CI:0.70~1.64), P=0.76]^{[ 21]}。Li等^{[ 11]}发现 LTA rs746868(G/C)基因多态性与非贲门胃癌患者的患病风险也无关。肖晖等^{[ 22]}同样也发现中国人群 LTA rs746868(G/C)多态性与胃癌易感性无关。

综上所述, LTA基因多态性与胃癌易感性的关系不是特别一致,尤其是 LTA rs909253(A/G)。这可能与多数研究的人群、种族、地域、遗传及环境等不同因素的影响有关。所以目前还不能得出某个位点基因多态性与胃癌患病风险的确切关系。为进一步完善这方面的研究,应尽可能排除实验方法、样本量、种族以及其他混杂因素的影响,以期为胃癌的早期防治提供有效的分子诊断指标。

基因多态性的检测方法也在不断发展和改进,新的测定方法层出不穷,如Taqman探针技术、基因芯片技术、变性高效液相色谱、基质辅助激光解吸附-电离飞行时间质谱、焦磷酸测序、荧光偏振技术等,其中Taqman探针技术和基因芯片技术是较常用的。在上述方法的基础上还涌现了一些新的高通量的SNP检测方法,如使用非对称PCR扩增和分裂DNA酶进行可视化DNA检测、SNP基因分型,在磁性纳米粒子上PCR扩增并用双色杂交系统进行SNP高通量检测^{[ 23, 24]}。此外,最近日本科学家建立了一种新的更简便、快速的SNP检测技术,即SmartAmp。该技术可在30~40 min内完成对临床上重要靶基因SNP位点的检测,且无需DNA分离和PCR扩增^{[ 25]}。

其中Taqman探针技术和基因芯片技术已成功地应用于 LTA基因多态性检测以及其他炎性细胞因子的检测^{[ 26]}。但是,目前在LTA基因多态性研究中大多数学者采用的仍是PCR-RFLP、荧光定量PCR、高分辨率熔解曲线(high resolution melting,HRM)等。这些方法简便易行,适用于小样本量研究,因而也可能是导致 LTA基因多态性与胃癌易感性之间不同研究的结果不一致的一个因素。尽管新的方法还尚未推广应用于 LTA基因多态性的检测,但是其具有良好的发展前景。相信未来这些新方法会更利于发现与胃癌易感性相关的特异SNP位点,并促进已发现的SNP位点的规范化研究。

目前, LTA基因SNP位点与胃癌易感性关系的研究已成为遗传领域研究的热点,其在胃癌的早期诊断、治疗及预后等中具有良好的应用前景。胃癌是我国的常见肿瘤,其发病率与死亡率均较高。如果确定了中国人群中 LTA SNP的等位基因、基因型或单体型与胃癌易感性显著相关,那么就可以以此SNP作为分子遗传标志,进行有选择的分子诊断,从流行病学角度调查患胃癌的高危人群,评价患病危险程度,从而建立有效的预警系统,达到有效预防的目的。此外,还可以通过对胃癌相关的遗传易感基因SNP的研究,确定其对放、化疗的敏感性以及患者预后的影响,选择对胃癌的基因治疗有效的靶点,促进靶向治疗药物的开发。

随着基因多态性高通量筛选技术的快速发展,我们可以绘制出高密度、高分辨率的人类基因组单体型图谱(Hapmap),快速、准确地定位易感基因,使临床个体化药物治疗成为可能。这必将为胃癌相关研究开创新的领域^{[ 27]} 。