凝血酶原时间(prothrombin time,PT)、活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time,APTT)、凝血酶时间(thrombin time,TT)及纤维蛋白原含量等项目是临床最常用的凝血功能检测项目,用于初步分析出血性疾病可能的病因,评估患者术前凝血功能状态及口服抗凝药物治疗检测等。近年来,D-二聚体也越来越多地进入临床常规检测,用于评估纤溶系统活性,辅助诊断弥散性血管内凝血(disseminated intravascular coagu-lation,DIC)及除外诊断深静脉血栓等。中国合格评定国家认可委员会(China National Accreditation Service for Conformity Assessment,CNAS)、美国病理学会(College of American Pathologists,CAP)、美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)等机构都有对凝血功能检测质量保证的条款及文件要求^{[ 1, 2, 3]};2013年11月中华医学会检验分会、卫生部临床检验中心和《中华检验医学杂志》编辑委员会联合发布的《出血性疾病诊断治疗中实验室检测项目的应用建议》(以下简称《建议》)^{[ 4]}从分析前、分析中及分析后全过程对凝血功能检测及其他出血性疾病相关检测提出了质量保证及临床应用的建议。对于有着年检测量超过100万测试数的巨大标本量压力的临床实验室,有些质量保证要求可能会因耗时、耗力、严重影响检测完成时间(turnaround time, TAT)或认为此类情况很少发生等原因而被忽视。然而这些被忽略的细节造成的检测结果错误可能会影响临床决策,甚至危及患者生命安全。我们想就临床常用凝血功能检测工作中以下这些常见问题及如何解决做一些经验交流和分享。

标本采集使用3.2%(109 mmol/L)的枸橼酸钠抗凝,并且与全血的抗凝比例为1∶9是凝血功能检测标本最基本的要求。如果采血量不足,会使标本中枸橼酸钠过剩,螯合PT或APTT检测试剂中的钙离子,导致人为延长的PT或APTT结果。如果患者的红细胞压积较高(常见于真性红细胞增多症、严重心肺疾病患者等),一般≥55%时,可能会出现一个类似但更为微妙的问题。一般情况下,红细胞压积为40%的10 mL全血中含有6 mL的血浆。如果红细胞压积异常升高,比如65%,那么标本只含有3.5 mL的血浆,即便采血量足够,也会导致血浆中枸橼酸钠过剩。

本科室自2007年来一直坚持对不合格标本的原因进行深入分析,并与临床护士进行沟通交流。总结采血量不足的主要原因除了一些患者血管及外周循环条件不佳外,还包括真空采血系统蝶翼针采血时第1管采集凝血检测标本;采血工作人员不了解抗凝剂与全血比例的重要性,认为检测项目少时可少抽血等^{[ 5]}。因此对于采血工作人员的培训是减少采血量不足的最重要的措施。对于高红细胞压积标本,需要根据红细胞压积计算抗凝剂比例,真空采血系统因抗凝剂与全血比例固定,无法调整,为了不增加临床护士的额外工作,我们会及时联系临床医生,做好患者沟通工作,然后由检验科的采血工作人员使用自配抗凝管和注射器到临床重新采血。此外我们也在实验室信息系统(laboratory information system,LIS)中设置了审核规则,当患者同时检测血常规和凝血功能,红细胞压积≥55%时,会在凝血功能检测结果审核时做出警示。

标本离心的一般要求为1 500× g离心15 min。不同型号离心机的离心半径不同,应实际测量后将离心力换算成正确的离心转速。定期对离心机进行校准,并验证离心后的乏血小板血浆中血小板计数是否达到<10×10⁹/L的要求。

对于凝血功能检测标本保存条件国内外学者一直有在研究探讨,报道结论也不完全一致^{[ 6, 7, 8]}。《建议》要求在24 ℃保存条件下,PT和APTT标本应分别在24 和4 h内完成检测。此外,由于血小板α颗粒中释放的血小板第4因子(platelet factor 4,PF4)可以中和肝素的活性,使APTT缩短,对于普通肝素治疗的患者更因在1 h内分离血浆。对于标本量巨大的大型综合医院,难以保证所有标本检测能在标本采集后4 h内完成;流程上实验室也很难优先在4 h内完成APTT的检测,然后再检测其他项目。本科室早在2010年验证了在自己实验室温度、湿度条件下标本保存的稳定性^{[ 9]}。我们发现对于不同保存时间后检测结果的变化是否影响临床诊疗的判断不应单纯套用统计学分析结果,至少应包括检测系统固有的不精密度、检测项目的生物学变异及临床需求等方面。此外,开盖标本挥发对检测结果有明显影响。因此在任何保存条件下,标本应在检测前才开盖,而不是完成离心后立即去盖。对于普通肝素治疗的患者我们也与临床医生沟通,希望此类标本申请急诊检验,能保证标本采集后及时送检,1 h内完成血浆分离。

对于严重脂血、黄疸的标本,《建议》指出可以使用机械法原理的仪器检测。但对于没有配备机械法原理检测仪器的实验室,严重脂血标本可以使用高速离心分离脂质后再进行检测^{[ 10]};严重黄疸的标本可进行手工复检。手工复检试剂可使用仪器检测试剂并参照说明书推荐的手工方法进行操作,需注意标本和试剂的预温。由于人工计时和凝固判断的误差较大,应至少检测2次,报告均值。如2次检测结果之间差异较大,应再进行复检。对于溶血标本,由于破碎红细胞会释放促凝物质影响检测结果准确性,实验室应退收标本;但检测人员也应了解临床常见病理性溶血状态,如我院最常见的需要进行体外循环的心脏手术术后,患者可因机械损伤存在明显体内溶血,此类标本因予以检测。

对于凝血功能检测人员需要进行全面的培训,使其掌握凝血的基础原理、所用检测方法的原理、检测系统的操作和性能、影响检测结果的各种因素、临床常见出血性及血栓性疾病实验室检测结果的特点、各种抗凝药物的作用机制等等;并且也要培养其注重细节、确保检测结果准确性的质量意识。此外,检测人员的相对固定也有助于其经验的积累和业务水平的提高。在美国、欧洲等实验室,异常凝血功能检测结果都需要临床医师的审核和结果分析,实验室的临床医师也可以直接开具进一步的检测项目医嘱。随着我国检验医师培训制度的深入完善和成熟,将来也可由检验医师来负责相关工作。

凝血功能检测试剂批号更换时除了如同常规生化检测项目需要进行定标(Clauss法检测纤维蛋白原含量等)以及新鲜标本比对外,还需要进行参考区间验证和正常参比血浆PT的重新建立(PT检测)。参考区间验证应至少进行20例表面健康人群(除外血液系统疾病、肝脏疾病、使用抗凝药物等)标本检测,如有2例以上标本检测结果超过现用参考区间时应重新建立参考区间。参考区间是临床判断患者健康与否以及疾病诊断、治疗、预后判断的重要依据。但是如果因试剂批号更换导致频繁的参考区间更改,除了检验科需要付出大量人力物力成本外,也会造成临床医生对检测结果解读的困惑。因此检验科应要求试剂供应商减少试剂批号更换的频率,如每年更换1~2次试剂批号;同时科室内部应做好试剂管理工作,避免发生不同批号试剂混用的情况,并能在新批号试剂启用前几天提醒工作人员及时完成相关工作。如确实需要重建参考区间,应提前与临床做好充分的沟通和解释。

不同于血清肌酐或促甲状腺激素检测结果的升高直接提示肾功能受损或甲状腺功能低下,对凝血功能检测结果进行解释应结合临床信息和其他实验室检查结果。许多临床情况都可能会引起不明原因的出血, 表1可以帮助检测人员分析出血原因及协助临床进行进一步的检查。

表1

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表1 不明原因出血时检测项目的应用和结果分析 步骤 检测的原因 检测项目 检测的目的 下一步骤 1 不明原因的出血 PT、APTT、纤维蛋白原、血小板计数 评估外源性、内源性和共同凝血途径以及血小板数是否充足 2 2 PT延长、APTT延长 1∶1混合试验 评估凝血因子缺乏或抑制物引起的功能障碍 3或4或5 3 混合试验得到纠正 特定凝血因子活性测定 评估凝血因子缺乏或华法林治疗 如果Ⅷ因子活性降低,进行7和8 4 混合试验不能纠正 TT 排除肝素污染 若排除了肝素污染,进行6 5 混合试验不能纠正 抗Ⅹa因子检测 6 混合试验不能纠正,并排除肝素污染 分析特定凝血因子抑制物 排除获得性血友病和其他凝血因子抑制物 7 Ⅷ因子活性降低 vWF抗原及活性检测 排除vWD 8 Ⅷ因子活性降低或血浆凝血功能检测正常且血小板计数正常 血小板功能筛查 排除vWD和血小板功能障碍 9 之前所有的检查都在正常范围内 因子筛查,纤溶异常检查(如血栓弹力图) 排除纤溶问题 注:vWF为血管性血友病因子

表1 不明原因出血时检测项目的应用和结果分析

与临床的良好沟通要求检测人员走出实验室,到临床具体了解患者基础疾病、用药情况以及有无出血表现等,才能获得完整的信息,对异常结果做出合理的解释。检测人员也应了解自己医院临床患者的特点和最常见的情况,例如我们医院遇到较多的临床医生提出凝血功能检测结果延长,与患者病情不符的情况,主要见于患者使用具有活血化瘀功效的中药制剂,使用经胆道排泄的抗菌药物或广谱抗菌药物未补充维生素K。又如检测人员应了解自己医院常规使用肝素抗凝治疗的临床科室,遇到这些科室以外的患者凝血检测出现APTT、TT检测结果明显延长(通常TT延长较APTT更明显),PT检测结果正常时,应联系临床确认患者是否使用了肝素抗凝,排除经肝素封管的留置管采血的情况。

凝血功能检测对检测人员和负责结果解释的临床医生都提出了许多挑战,检测人员间应经常相互探讨提高检测质量的可行性途径;检测人员也因加强与临床的沟通和联系,了解临床的切实需求,获得临床对检测结果的真实评价,协助临床医生一起合理选择检测项目及解释结果。