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顾伟鸣, 杨阳, 吴磊, 郭玮, 宋斌斌, 邓安梅, 王庆忠. 梅毒血清学试剂性能评估方案的优化及应用. 29(11): 1169-1174
GU Weiming, YANG Yang, WU Lei, GUO Wei, SONG Binbin, DENG Anmei, WANG Qingzhong. Optimization and application of performance evaluation protocol for syphilis serologic assays. Labratory Medicine, 29(11): 1169-1174  
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梅毒血清学试剂性能评估方案的优化及应用
顾伟鸣1, 杨阳1, 吴磊1, 郭玮2, 宋斌斌2, 邓安梅3, 王庆忠4
1.上海市皮肤病医院,上海 200443
2.复旦大学附属中山医院,上海 200032
3. 第二军医大学附属长海医院,上海 200433
4.上海市临床检验中心,上海 200126

作者简介:顾伟鸣,男,1962年生,硕士,副主任技师,主要从事性病实验诊断与实验室管理研究。

基金:上海市科委择优委托项目(09DZ1907104); 卫生标准专业委员会委托项目(20120905);
摘要
目的

制定优化的梅毒血清学试剂的评估方案,探讨新方案在发现试剂检测性能特征的价值。

方法

优化的评估方案首次引入最低检出限、抗干扰性、稳定性等技术参数,采用国际抗梅毒标准血清进行测量值溯源,选择国产梅毒血清学试剂及相对应的进口试剂共6种,以多中心方式进行检测性能的评价。

结果

456例明确诊断样品的定性试验,梅毒免疫层析法结果与诊断100%符合;其它4种梅毒筛查试剂相互间虽然敏感性和特异性差异无统计学意义,但存在不同程度的假阳性和假阴性;最低检测限浓度由高到低分别是筛查试剂、梅毒螺旋体凝集法、免疫层析法、和酶联免疫法/化学发光法;两种促凝真空采血器96.88%干扰筛查试剂。

结论

国产梅毒血清学试剂的检测性能媲美进口产品。免疫层析试剂与临床诊断高度符合,且敏感性水平超过了传统的方法,为推广应用奠定了基础。新的梅毒血清学试剂的评估方案,更完整地反映以往被忽略的影响因素。

关键词: 梅毒; 血清学; 检测性能; 评估方案; 即时检验; 最低检测限
中图分类号:R446.11 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2014)11-1169-06
Optimization and application of performance evaluation protocol for syphilis serologic assays
GU Weiming1, YANG Yang1, WU Lei1, GUO Wei2, SONG Binbin2, DENG Anmei3, WANG Qingzhong4
1.Shanghai Skin Disease Hospital, Shanghai 200443, China
2. Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China
3. Changhai Hospital, the Second Military Medical University, Shanghai 200433, China
4.Shanghai Center for Clinical Laboratory, Shanghai 200126, China
Abstract
Objective

To design and optimize performance evaluation protocol for syphilis serologic assays, and to investigate the significance of new protocol for discovering the characteristics of assay performance.

Methods

Technical parameters, such as lower limit of detection, interference and stability were introduced firstly into the optimized performance evaluation protocol, and 6 domestic and imported assay reagents for syphilis serology were evaluated according to the protocol by multi-center joint study.

Results

The qualitative test for 456 definite specimens showed 100% agreement result between point-of-care testing and clinical diagnostic test, and exhibited various degrees of false positive and false negative results among the other 4 screening assays, although their sensitivity and specificity had no statistical difference. The lower limits of detection of the reagents descended from high to low in the order of screening assays were treponema pallidum particle agglutination assay, point-of-care testing and enzyme-linked immunosorbent assay/chemiluminescence immunoassay. Two brands of procoagulant vacuum blood collection tubes interfered with non-specific antibody detection reagent for syphilis in a 96.88% proportion.

Conclusions

The study shows that the performance of domestic syphilis serologic assays is comparable with that of imported ones. The result by point-of-care testing exhibits a high agreement with clinical diagnostic test result, and its sensitivity is better than that of the traditional method, which lays a foundation for spreading in clinical application. The optimized performance evaluation protocol for syphilis serologic assays would reflect assay performance better.

Keyword: Syphilis serology; Assay performance; Evaluation protocol; Point-of-care testing; Lower limit of detection
引言

梅毒是由苍白螺旋体感染所引起的一种慢性传染性疾病,它主要通过性传播方式感染[ 1],并可以增加人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的机会[ 2]。据2012年全国性病监测系统的资料表明,梅毒发病率为33.30/10 万,已位居全国甲乙类法定传染病排序的第三位[ 3],其疫情形势依然严峻。

梅毒血清学试验是梅毒实验室诊断最重要方法[ 4, 5]。根据试剂反应的抗原不同可分为两类:一类是以快速血浆试验(rapid plasma reagin circle card test,RPR)或甲苯胺红不加热血清试验(toluidine red unheated serum test,TRUST)为代表的梅毒非特异性抗体试验,主要用于梅毒的筛查、疗效检测和治愈判断,通常称筛查试验;另一类是以梅毒螺旋体凝集实验( treponema pallidun particle agglutination assay,TPPA)为代表的梅毒特异性抗体试验,通常称确诊试验。近年来,以免疫层析法为原理的床边检验(point of care testing, POCT)试剂已经在临床应用。世界卫生组织(WHO)推荐在性传播感染(sexually transmitted infections,STIs)门诊使用POCT试剂,以期通过快速检测、早期诊断和治疗等手段,达到控制梅毒流行的目的[ 5]。

但是,梅毒血清学试验的检测质量存在许多问题。区域性梅毒血清学室间质量评价发现:对同一个血清样品,不同医疗机构实验室的检测结果存在显著差异,试剂是影响检测质量的重要因素之一[ 6]。为了客观地了解梅毒血清学试剂的检测性能,我们制定优化了新的评价方案,由4个不同的医疗机构共同参与,对梅毒血清学检测试剂的敏感性、特异性、最低检出限、抗干扰性、稳定性等参数进行了系统地评价。本项目获得参与单位伦理委员会批准。

材料和方法
一、材料

1.标本来源

收集各级医疗机构性病门诊各期梅毒患者、其它门诊的非梅毒患者(包括肿瘤、麻风、系统性红斑狼疮、病毒性肝炎)及孕妇和体检者血清共计456例,其中各期梅毒患者209例(占45.83%,TPPA和酶联免疫试剂同时复测呈阳性反应)、非梅毒患者247例(占54.17%,TPPA和酶联免疫试剂同时复测均呈阴性),男218例(47.80%)、女238例(52.20%)。年龄最小17岁,最大年龄91岁,平均年龄45.03岁(详见 表1)。梅毒入选病例经过流行病学、临床诊断和梅毒血清学检测的综合判断,符合各期梅毒诊断[ 1];其它疾病符合相关诊断标准,结合流行病学和血清学排除梅毒。所有患者采集当天空腹血样,排除溶血、脂血等可能干扰试验的因素。

2.参与单位

上海市皮肤病医院、上海市临床检验中心、复旦大学附属中山医院、第二军医大学附属长海医院。

3.标准物质

抗梅毒IgG和IgM国际标准物质(编号05/132、05/133)(The National Institute for Biological Standards and Control,NIBSC)[ 7];干扰标准物质:胆红素*F(游离型)、胆红素*C(结合型)、溶血血红蛋白和乳糜(批号:ZS0002,希森美康医用电子(上海)有限公司)。

4.质控品

抗梅毒质控血清(NIBSC编号09/B585-01、09/B559-03)[ 7]。

5.试剂与耗材

(1)试剂:国产试剂RPR(批号:20100801,上海科华生物技术有限公司,简称RPR-KH)、TRUST(批号:20100701,上海荣盛生物药业有限公司,简称TRUST-RS)、Tp-POCT(批号:RD20101001,上海凯创生物技术有限公司,简称Chemtrue-TP),以及相对应的进口试剂 RPR(批号:102381LE,Stanbio Laboratory,Texas,USA。简称RPR-SL )、TRUST(批号:196P,New Horizons Diagnstics Corporation,Columbia,Maryland,USA。简称TRUST-NHD)、Tp-POCT(批号:09631K101,Alere medical sales co.,lt,USA。简称Determine-TP),以上试剂合称“6种试剂”;4种RPR和TRUST试剂合称“筛查试剂”;(2)梅毒确诊试剂:梅毒螺旋体颗粒凝集试剂(批号:WN00708,Fujirebio Inc. Japan。简称TPPA)、和酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA) (批号:TS96-100811T,Phoenix Bio-Tech Cor。Newyork,USA。 简称ELISA-PB);(3)真空采血器:4种促凝真空采血器分别是碧迪医疗器械(上海)有限公司(货号367812,批号0305231,简称“BD”)、浙江拱东医疗科技有限公司(货号GD050A,批号110564,简称“Gongdong”)、上海科华检验医学产品有限公司(货号230611,批号20110221,简称 “KHB”)、山东威高集团医用高分子制品股份有限公司(货号:血清生化促凝管,批号20110408,简称 “Wego”)。

6.仪器

梅毒血清学水平混匀仪(苏州市东吴医用电子仪器厂),酶免疫洗板仪(ELx50,BIO-TEK,USA)和酶免疫阅读仪(ELx800,BIO-TEK,USA)。

二、方法

1. 敏感性和特异性分析

各期梅毒患者209例、非梅毒患者247例(包括肿瘤、麻风、系统性红斑狼疮、病毒性肝炎及孕妇和体检者)的血液分离血清样本,同时采用TPPA和ELISA-PB复检,确认检测结果呈一致性。用“筛查试剂”分别进行定性和半定量试验[ 8];用POCT试剂进行定性试验。按“诊断明确的定性检测性能评估方法”[ 9],以临床诊断为标准,评价试剂的敏感性、特异性和总符合率。

2. 抗干扰试验

(1)干扰物质的影响作用:按照血液中可能出现最高病理浓度的标准[ 10],分别将四种干扰标准物质加入到10份梅毒(非特异性抗体定性试验弱阳性)和10个健康者的血清样品中。用“6种试剂”进行检测,比较添加干扰物质前后,样品检测结果的一致性;(2)采血器的影响作用:招募32名健康志愿者,用4种不同品牌的促凝真空管及洁净玻璃管对照同时采集血液,分离血清后使用“6种试剂”分别进行检测,观察不同促凝真空管是否干扰梅毒血清学试验。

3.最低检出限(lower limit of detection,LLD)

用健康者血清按1/40比例,对NIBSC标准血清进行连续梯度稀释,制成不同抗体浓度的标准血清盘。用“6种试剂”对各浓度水平的血清盘分别进行检测。记录每种试剂呈现反应的最高稀释倍数,即为该试剂的LLD[ 11]。

4.稳定性试验

根据加速老化和环境温度、试验时间与有效期之间存在以下关系:试验时间(周)=剩余有效期时间(周)/2(老化实验温度-存储温度)10 公式[ 12],选择37℃水平进行老化试验,试验结束后试剂取出时,相当于该试剂的有效期末。分别将老化实验前后的“6种试剂”试剂,对10份梅毒(非特异性抗体定性试验呈现弱阳性)和10份阴性血清样品,进行检测。

5.质量控制

(1)研究期间使用的标准物质、质控品和试剂,均为同一批号;(2)计量器具均经过校准、鉴定。并严格按照试剂说明书操作;(3)每次试验,均用NIBSC抗梅毒质控血清、试剂盒中的阴阳性对照品同步进行实验,只有在检测结果受控的情况下,研究结果才有效。

6.实验操作与结果判读

1人独立地实验操作、记录观察结果;另1人再次独立地复核观察结果并记录。当2人记录出现差异时,由第2人再次独立地复检,取2次相同记录作为最终结果。

三、统计学方法

所有数据输入EXCEL,并导入SPSS 17.0 进行统计分析。总体敏感性和特异性使用可信区间比较,定性试验用配对卡方检验,半定量试验的滴度数值用配对 t检验,以 P>0.05判断对比组之间差异有统计学意义。抗干扰和稳定性试验比较试验前后结果的一致性。最低检出限描述不同试剂的检出浓度。

结果
一、敏感性和特异性

1. 定性试验结果

与临床明确诊断病例比较,“筛查试剂”对各期梅毒的检出率分别为一期梅毒(90%93.3%)、二期梅毒(98.9%100%)、潜伏梅毒(94.9%100%)、神经梅毒(95.5%100%);敏感性范围是99.04%95.69% ( χ2=6.399, P=0.094),各试剂之间的敏感性差异无统计学意义,按照降序排列为TRUST-RS、RPR-KH、TRUST-NHD和RPR-SL;特异性范围是97.98%96.76%( χ2=1.028, P=0.794),各试剂之间的特异性差异无统计学意义,按照降序排列是TRUST-RS、RPR-KH、TRUST-NHD和RPR-SL;总体符合率范围是98.46%96.61%( χ2=3.766, P=0.288), 各试剂之间的符合率差异无统计学意义,按照降序排列是TRUST-RS、RPR-KH、TRUST-NHD和RPR-SL。2种 POCT试剂的敏感性、特异性和总符合率均为100%。详见 表1。

表1 456例临床样品的梅毒血清学检测结果一览表

2. “筛查试剂”的假阴性和假阳性

以梅毒组209例样品检测无反应性作为假阴性,RPR-KH、RPR-SL、TRUST-RS、TRUST-NHD试剂分别有1.4%(3例)、4.3%(9例)、1.0%(2例)和3.3%(7例)漏检,其中2例临床硬下疳的一期梅毒,“筛查试剂”都未能够检出;以非梅毒组247例样品检测有反应作为假阳性,RPR-KH、RPR-SL、TRUST-RS、TRUST-NHD试剂分别有3.2%(8例)、2.4%(6例)、2.0%(5例)和3.2%(8例)的假阳性,其中1例麻风、2例系统性红斑狼疮和1例丙型肝炎“筛查试剂”都有反应。详见 表2。

表2 23例“筛查试验”检测不一致结果一览表

3. 半定量试验结果

“筛查试剂”半定量试验的滴度结果,以每2种试剂的敏感性配对 t检验,分别是RPR-KH/RPR-SL( t=3.919, P=0.000)、TRUST-RS/TRUST-NHD ( t=1.891, P=0.059)、TRUST-RS/RPR-KH ( t=1.258, P=0.209)、和TRUST-NHD/RPR-SL ( t=3.613, P=0.000)。由于RPR-SL试剂的敏感性较低,引起与其它试剂之间滴度的差异有统计学意义。

二、抗干扰试验

1. 抗干扰物质的影响作用

模拟人体最高病理浓度的游离型胆红素(40mg/dl)、结合型胆红素(20mg/dl)、血红蛋白(500mg/dl)和乳糜微粒(1 520度)的样品[ 10],“6种试剂”均表现100%的抗干扰能力。

2. 不同采血器的影响作用

采集的32例样品中,“KHB”和“Wego”二种促凝真空管的样品,对“筛查试剂”均出现31例假阳性(96.88%),结果在±~+之间;“BD”和“Gongdong”二种促凝真空管的血清样品,对“筛查试剂”均无干扰现象。4种真空管对POCT试剂无干扰现象。

三、LLD

“筛查试剂”对NIBSC标准物质的最低检测浓度分别是TRUST-RS(112 mIU/mL)、RPR-KH(150 mIU/mL)、TRUST-NHD(187 mIU/mL)和RPR-SL(225 mIU/mL),最高与最低浓度差值相当于半定量试验的对倍稀释度。梅毒特异性抗体试剂的最低检测浓度分别是TPPA(60mIU/mL)、Chemtrue-TP/Determine-TP(15 mIU/mL)、ELIAS-PB/CLIA(化学发光)(1.87 mIU/mL)。详见 表3。

表3 各种试剂对NIBSC标准物质的LLD结果一览表
四、稳定性试验

“6种试剂”加速老化试验的前、后,对10份弱阳性和10份阴性的样品检测发现,仅TRUST-NHD对原来阴性样品检测出现2例微弱假阳性外,其余5种试剂的检测结果均未见改变。

讨论

试剂的检测性能评价方案,一直被质量管理部门所重视。随着科研技术的进步,对疾病的发展规律有新的认识,需要不断地优化检测和诊断试剂的评价。在梅毒血清学试剂的评价中,我们首次引入了 “LLD”[ 13]、“抗干扰”和“老化实验”等技术参数,加深认识梅毒血清学试剂在梅毒实验诊断中的价值。一些过去忽略的影响因素被清晰地显现出来。

NIBSC抗梅毒IgG和IgM标准物质被WHO认定为梅毒血清学标准品,它是人类梅毒感染者的血液制品[ 14]。对标准物质测定提供了一个直观的度量数值,相应的实验数据具有朔源性。LLD验证了不同试剂之间存在的敏感性差异和大小程度,以此我们可以确定每种试剂的特性。以这个参数为纽带,今后毫无关联的2个评估报道,实验结果相互之间的可比性更加具有科学依据。

对456例明确诊断病例的样品检测,定性试验中“筛查试剂”对各期梅毒存在不同程度的漏检,对2例硬下疳的一期梅毒(从LLD结果推断抗体浓度在112 mIU/mL60 mIU/mL之间)均没有检出。“筛查试剂”对肿瘤、麻风、SLE、丙型肝炎甚至孕妇和体检者有不同程度的假阳性。多种因素引起梅毒血清学的生物学假阳性的事实已经被公认[ 1, 4],有趣的是,4例曾经接受过梅毒规则治疗的肿瘤和SLE患者( 表3中序号912),“筛查试剂”全部呈阳性反应,到底是什么原因引起的:生物学假阳性?梅毒血清固定阳性?尚处于疗效监测过程中?还是多重因素的叠加效应,有待进一步探讨。我们研究结果客观地反映了筛查试剂在临床应用中的局限性。需要结合流行病学和临床表现,补充梅毒特异性抗体试验以提高梅毒诊断的准确率。

值得我们注意的是,定性试验中“筛查试剂”之间的敏感性和特异性差异无统计学意义( P>0.05)。但是,在半定量试验中,RPR-SL与其它3种试剂的敏感性差异有统计学意义 ( P<0.01)。恰恰这是梅毒非特异性抗体试验的重要价值,因为滴度水平和变化趋势,是临床医生判断疗效的唯一指标。梅毒疗效监测需要较长期的过程,实验室随意更换不同品牌的试剂或者患者更换不同医院进行随访,都有可能因为试剂的系统误差,引起检测结果不确定的改变,给临床医生判断带来疑惑。

Chemtrue-TP和Determine-TP定性试验的检测结果与临床诊断100%符合。

梅毒血清学试验的干扰能力以往未见报道。血糖和血脂检测要求患者空腹已经是常识,真空采血器对生化免疫结果的影响也被大量报道。本研究优化了“抗干扰性”试验的设计。第一,无论生理、病例或不当采集导致收集的样品出现血红蛋白、脂血等异常现象,是否会增加梅毒非特异性抗体试验结果判断的难度。研究结果显示,最高病理浓度下“6种试剂”均没有影响,但是我们仍然需要避免严重的溶血和脂血。第二,使用含促凝剂真空采集器已经非常普及,国产品牌的促凝剂成份和含量往往没有标注,用户无法获得添加剂抗干扰性能的参数。我们发现2个品牌的促凝真空采集器,引起筛查试验96.88%的微弱假阳性结果。提示用户应该根据检测项目谨慎选择采集器,厂商也应该重视产品质量的改进工作。

最低检出限是衡量检测试剂敏感性的重要指标[ 11]。在梅毒血清学试剂评估中首次引进LLD,了解不同试剂的敏感性差异及大小程度,直观地判读不同试剂的敏感性特征。从 表2看到各种试剂展示不同层级的敏感性水平。“筛查试剂”TRUST-RS(112 mIU/mL)和RPR-SL(225 mIU/mL)之间存在1个滴度敏感性差异,可能与试剂的抗原原料、制备工艺不同有关。提示实验室应该使用同一品牌的试剂。一定间隔周期的2次检测结果变化和趋势,是疗效监测和治愈判断的依据。由于不同品牌试剂会导致检测结果系统性误差,从而干扰临床判断。梅毒特异性抗体试剂的LLD检测水平相距较大(从2 mIU/mL至60 mIU/mL),这个研究结果解释了检验科常见的疑问:ELISA/CLIA检测的临界值结果与TPPA检测结果的矛盾原因[ 15]。如果需要对ELISA/CLIA检测处于灰区结果进行再次确认,采用敏感性接近ELISA/CLIAD 水平的Chemtrue-TP更适合。

验证梅毒试剂盒上标称有效期的稳定性,过去鲜见报道。我们设计了加速老化试验,在模拟条件下观察有效期末的试剂是否降低了检测性能。研究表明TRUST-NHD出现了2例假阳性,说明在极端环境条件下,有可能改变试剂的检测性能。

总之,通过优化梅毒血清学试剂的评估方案,精细地展示了一系列检测性能的客观参数,标准物质的引入使得检测数据具有溯源性。TRUST-RS检测性能具有较高的功效率,RPR-KH敏感性过高以致出现较多假阳性,但是作为梅毒筛查工具,这种高敏感仍然可以被接受。Chemtrue-TP的敏感性和特异性与临床诊断高度符合。国产梅毒血清学试剂的整体检测性能媲美国际一线品牌。

The authors have declared that no competing interests exist.

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