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曹凌峰, 苏犁云, 董妞妞, 徐锦. 荧光恒温扩增技术检测肠道病毒71型方法的建立与评价. 29(11): 1115-1119
CAO Lingfeng, SU Liyun, DONG Niuniu, XU Jin. Establishment and evaluation of fluorescence isothermal amplification assay for the detection of Enterovirus 71. Labratory Medicine, 29(11): 1115-1119  
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荧光恒温扩增技术检测肠道病毒71型方法的建立与评价
曹凌峰, 苏犁云, 董妞妞, 徐锦
复旦大学附属儿科医院临床检验中心,上海 201102

作者简介:曹凌峰,男,1972年生,硕士,副主任技师,主要从事病毒学检验及机制研究。

通讯作者:徐 锦,联系电话:021-64931893。

基金:上海市公共卫生优秀学科带头人计划(GWDTT201221);
摘要
目的

利用荧光恒温扩增(SAT)技术建立一种快速可靠的肠道病毒71型(EV71)检测方法。

方法

通过设计特异性的EV71 RNA扩增引物及优化探针技术,使用M-MLV反转录酶及T7 RNA多聚酶对EV71 RNA 进行核酸扩增,同时利用荧光定量聚合酶链反应(PCR)仪进行实时的荧光信号收集和检测。检测复旦大学附属儿科医院儿童手足口病患儿粪便样本199例,以EV71型核酸检测试剂盒作参比方法,DNA测序为第三方验证方法, 对研究数据进行Kappa一致性分析。

结果

SAT技术共检测到119例EV71阳性样本,其中21例荧光探针法检测为阴性,经测序证实20例样本仍为阳性。 SAT与荧光探针法检测结果的Kappa值为0.789。SAT方法的敏感性100%、特异性98.77%。

结论

本研究建立的EV71型RNA SAT技术具有敏感性高、特异性强、准确、快速可靠等优点,适用于临床对EV71感染的快速诊断。

关键词: 肠道病毒71型; 荧光恒温扩增技术; 手足口病; 敏感性; 特异性
中图分类号:R446.1 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2014)11-1115-05
Establishment and evaluation of fluorescence isothermal amplification assay for the detection of Enterovirus 71
CAO Lingfeng, SU Liyun, DONG Niuniu, XU Jin
Clinical Laboratory Center, Children's Hospital of Fudan University, Shanghai 201102, China
Abstract
Objective

To establish a rapid and reliable fluorescence isothermal amplification assay (SAT) for the detection of Enterovirus 71 (EV71).

Methods

By designing specific primers and optimal probe and using M-MLV reverse transcriptase and T7 RNA polymerase, the SAT was developed for detecting EV71 based on isothermal RNA amplification and fluorescence quantitation polymerase chain reaction (PCR). A total of 199 stool specimens from the children with hand, foot, mouth disease from Children's Hospital of Fudan University were determined. Using EV71 PCR fluorescence diagnostic kits as reference kit and DNA sequencing as the third party verification method, theKappa analysis was performed on the study data for consistency.

Results

A total of 119 stool specimens were positive by SAT, and there were 21 specimens being negative by PCR-fluorescence probe assay, but 20 specimens were confirmed to be positive by DNA sequencing. The Kappa value between SAT and PCR-fluorescence probe assay was 0.789. The sensitivity and specificity of SAT were 100% and 98.77%, respectively.

Conclusions

This study indicates that RNA SAT for the detection of EV71 is a sensitive, specific, accurate, rapid and reliable method, and it should be a potential method for the rapid detection of EV71 infection.

Keyword: Enterovirus 71; Fluorescence isothermal amplification assay; Hand; foot; mouth disease; Sensitivity; Specificity
引言

肠道病毒71型(EV71)是肠道病毒的一个亚型,其引起的手足口病多发生于学龄前儿童,尤以3岁以下年龄组发病率最高。EV71被认为是导致儿童手足口病死亡的主要病原体[ 1]。

当前实验室的主要检测方法有:病毒分离法、血清学检查和核酸扩增技术。其中病毒分离法是诊断EV71的金标准,但鉴定时间通常需1周以上,且需要特定的实验室等级和专业人员;免疫学方法耗时较短,但其特异性和敏感性均较低,诊断窗口期常常滞后于发病期;病毒核酸扩增技术因其耗时短,特异性和敏感性较高,已经成为近年来最普遍的病毒学检测方法之一[ 2],在国外甚至有学者提出可替代病毒分离而作为病毒诊断的金标准[ 3]。

荧光恒温扩增技术(simultaneous amplification and test, SAT)是近年来发展起来的一种新型的核酸扩增技术,结合特异性核酸恒温放大和同步荧光检测技术,只需在42 ℃的恒温条件下80 min内即可完成扩增反应,不需要热循环,较传统聚合酶链反应(PCR)法有更高的灵敏度和特异性。本研究拟建立从儿童粪便样本中检测EV71型的SAT方法,用于临床辅助诊断EV71感染。

材料和方法
一、样本收集

收集自2013年1月至6月经复旦大学附属儿科医院收治入院并确诊为手足口病的199例患儿的粪便样本。所有患儿诊断标准参照卫生部颁发的《手足口病诊疗指南》(2010年版)[ 4]:急性起病,口腔黏膜出现散在疱疹,手、足、和(或)臀部出现斑丘疹、疱疹,伴或不伴发热。每份粪便样本采集58 g,采集后立即置于无菌粪便采集管送病毒室-70 ℃保存。

二、引物和探针

根据EV71的保守区域VPl编码区特异性核苷酸序列设计引物[ 5],并将T7启动子序列并入到引物序列,见 表1。使用M-MLV反转录酶将EV71 RNA反转录成DNA片段,并在T7 RNA多聚酶转录成RNA来进行SAT。同时标记特异性的EV71探针,在5'末端标记荧光报告基团6-carboxyfluorescein phosphoramidite(FAM), 3'末端标记4-[4-(dimethylamino) phenylazo benzoic acid N-succinimidyl ester (DABCYL)用于检测与目标RNA相结合释放出的荧光信号,该荧光信号可被荧光定量PCR扩增仪捕获。同时设计并标记竞争性内标探针(internal control;IC-probe), 5'末端标记5-hexachloro fluorescein(HEX),3'末端标记DABCYL做为EV71靶RNA的内标,用于判断EV71 RNA的特异性扩增。

表1 SAT-EV71的引物和探针序列
三、SAT检测

粪便上清液(20%,w/v)按照RNA纯化试剂盒的标准操作步骤(上海仁度生物技术有限公司)提取EV71 RNA。首先,200 μL粪便上清液加入200 μL裂解液至1.5 mL离心管,管内含混合寡核苷酸的磁珠微粒用于捕获EV71 VP1核酸,然后加入100 μL核酸提取液和10 μL的内标RNA(IC-RNA)(5 000拷贝数,Invitrogen, carlsbad, USA), 混匀30 s后,60 ℃孵育5 min,室温静置10 min后,将离心管置于磁力架上用洗脱液冲洗5 min,所有液体包含未结合的核酸和细胞碎片均从磁珠上洗脱下来,RNA结合的磁珠备用下一个反应。30 μL反应体系,包括50 μM dNTPs, 187.5 nM EV71-特异性引物, 各125 nM FAM标记EV71-特异性探针和HEX标记的IC探针e,和制备好的有RNA结合的磁珠一起转移至200 μL PCR反应管中,60 ℃孵育10 min,再42 ℃ 5 min。然后管中加入10 μL酶,包含2 000U逆转录酶和2 000U T7 RNA聚合酶(Bioscience,RD; San Diego, USA),轻微混匀。反应管立即置 ABI-7500实时荧光定量PCR仪(Applied biosystems,foster city, USA)进行恒温扩增,42 ℃ 60 min, 每分钟收集1次FAM和HEX的荧光强度。dt值(样本曲线与阈值线交点的横坐标读数,与一般PCR试验结果的Ct类似)55设为cut-off值,dt≤55为阳性,55<dt<60为灰区(灰区样本需复检),dt无数值或60为阴性。

四、灵敏度和特异性测试

将从确诊手足口病患儿粪便中提取的RNA,经RT-PCR获得该片段的DNA拷贝,通过克隆系统将其插入载体pGM-T(北京天根生化科技有限公司), PCR初步鉴定后选择1个含有插入片段的阳性克隆进行测序鉴定,与EV71 病毒株VR-1433的进行比对。对上述测序鉴定的含有EV71 VP1基因片段的pGM-T载体进行体外转录,并对转录产物进行DNase处理并纯化(北京百泰克生物技术有限公司),对所制备纯化的EV71 RNA进行紫外分光光度计分析,检测其纯度并对其进行量的定值分析,从而得到用于检测灵敏度的EV71 RNA,依次梯度稀释转录好的EV71-RNA 100 000 -10拷贝做检测下限的测试。采用SAT-EV71同时检测以下病原体RNA,包括EV71、解脲脲原体、屎肠球菌、沙眼衣原体、柯萨奇病毒A16型、流感病毒、人巨细胞病毒、EB病毒、埃克病毒、副流感病毒、博卡病毒、轮状病毒、柯萨奇B型病毒,以进行方法的特异性测试。

五、参比方法及不一致样本的确认试验

采用EV71型核酸检测试剂盒[ 6] (RT-PCR荧光探针法:达安基因股份有限公司)同时检测199例粪便样本的EV71 RNA。为进一步确认EV71和CA16是否有交叉反应,用肠道病毒CA16型核酸检测试剂盒(RT-PCR荧光探针法:达安基因股份有限公司)检测所有EV71阳性的样本。

所有SAT-EV71阳性而荧光探针法阴性结果的以SAT的PCR产物进行测序验证,所有荧光探针法阳性而SAT阴性的,以荧光探针法的PCR产物测序验证,测序仪器为3730测序仪 (Perkin-Elmer Applied Biosystems, USA)

六、数据分析

将SAT-EV71方法与荧光探针法PCR进行比较,采用2×2列联表整理,进行 Kappa系数的分析,若 Kappa系数>0.8,为高度一致,认为两种方法检测结果等效;0.8< Kappa系数>0.4为较强一致,需进行阳性符合率和阴性符合率比较。同时计算特异性和敏感性。

结果
一、SAT-EV71的灵敏度测试结果

经过60个循环后的SAT-EV71反应,EV71 RNA转录产物最低检测量为10 copy,见 图1A;加入HEX标记的IC探针做为竞争性内标,可有效减少抽提污染而引起的假阴性,见 图1B。

图1 SAT EV71的扩增曲线及灵敏度测试注:A为FAM标记探针的扩增曲线;B为HEX标记竞争性内标探针的扩增曲线

二、SAT-EV71的特异性测试结果

同时检测解脲脲原体、屎肠球菌、沙眼衣原体、柯萨奇病毒A16型、流感病毒、人巨细胞病毒、EB病毒、埃克病毒、副流感病毒、博卡病毒、轮状病毒、柯萨奇B型病毒、阴性对照,均无EV71的特异性扩增曲线。提示SAT-EV71与上述病原体RNA均无交叉反应。

三、临床样本的检测结果

199例粪便样本中,SAT-EV71检出119例阳性,而荧光探针法检出98例,21例结果不符合的样本经PCR加测序验证,其中20例仍为EV71阳性,见 表2。所有119例阳性样本经荧光探针法检测CA16 RNA结果均为阴性。对表中基数资料进行 Kappa一致性分析,结果 Kappa系数为0.789(0.8>K>0.4),两种方法的检测结果具有较强一致性。阳性符合率=98/(98+0)×100%=100%, 阴性符合率=80/(80+21)×100%=79.21%。SAT-EV71方法的敏感性=119/(119+0)×100%=100%;特异性=80/(1+80)×100%=98.77%;准确性= (118+80)/199×100%=99.50%,见 表3。

表2 SAT-EV71法与荧光探针法检测EV71的结果比较
表3 SAT-EV71法的敏感性、特异性和准确性
讨论

EV71感染儿童后可引起患儿手、足、口腔等部位的斑丘疹、疱疹,重症患者表现为脑炎、脑脊髓炎、脑膜炎、肺水肿、循环衰竭等。目前,尚无有效的疫苗和抗病毒药物来预防和治疗EV71感染。因此,早期快速准确的诊断EV71是防控手足口病的重要手段之一。

我们建立了SAT-EV71 SAT[ 7],它结合了特异性核酸恒温放大和同步荧光检测技术,在本研究中199例粪便样本中共检出119例阳性,检出率为59.8%(119/199), 明显高于荧光探针法的49.2%(98/199),119例SAT阳性结果的样本经过PCR加测序证实有118例阳性,准确率为99.50%。同时SAT-EV71的阳性样本检测CA16等其它病原体RNA结果均为阴性,提示EV71与这些病原体RNA无交叉反应,进一步说明SAT-EV71有较高的特异性。SAT-EV71检测下限为10拷贝/反应,也优于荧光探针法数十倍。

SAT-EV71较传统荧光探针法能更有效的检出EV71,主要原因有:(1)高活性的T7 RNA多聚酶能够将DNA模板扩大到101 000倍,从而使扩增效率大幅度提高,只需80 min就能完成核酸扩增,较荧光探针法耗时更短;(2)SAT-EV71的扩增终产物是RNA,较RT-PCR的终产物DNA在反应管外更容易降解,避免可能的扩增产物污染,从而增加了方法的特异性;(3)本研究建立的SAT-EV71同Cui等[ 7]建立的SAT TB法不同,采用了IC-探针做为内标用于监测RNA抽提和核酸扩增,由于粪便中杂质较多,在抽提过程中难以避免的含有酶抑制剂,加入IC探针后,IC阳性的结果表明了扩增的真实性和有效性,从而最大限度避免了假阴性结果。

EV71病毒衣壳蛋白VP1是该病毒主要的中和决定因子,含有病毒的抗原决定簇[ 8]。 VP1基因具有与病毒血清型完全对应的遗传多样性,是进行分子定型和分子流行病学研究最主要的靶基因[ 9]。基于VP1核苷酸序列的差异,可将EV71分为A、B、C 3个基因型, 其中在亚太地区日本、台湾最早报道了HFMD爆发的基因型别分别是B型和C型[ 10, 11],而马来西亚、越南、新加坡、等亚太国家已报道的基因型也都是B、C型[ 12, 13, 14]。在中国大陆除了1997年爆发HFMD的基因型为C3外、从1998至2008年则均为C4型[ 15]。SAT-EV71引物设计不仅基于主要在中国大陆流行的C4型,也能检测出A型和B型[ 16],因此,对可能的输入性HFMD[ 17]的检出率也优于荧光探针法。

近年来,包括SAT在内的恒温扩增技术发展非常迅速,由于相比传统PCR具有更高灵敏度(100101拷贝),更短扩增时间,通常只需6090 min内完成扩增,被认为是有可能替代传统PCR的一项扩增技术。环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP) 技术,在2000年由Notomi等[ 18]报道。 LAMP 技术针对靶序列的6 个特异性区域设计23对引物,利用一种具有链置换活性的DNA 聚合酶在65 ℃左右保温30 60 min,即可扩增出109 拷贝靶序列。LAMP近年来在细菌、病毒、寄生虫上的广泛使用,已经成为核酸研究领域的重要工具。相比LAMP-EV71方法,SAT-EV71有以下优点:(1)LAMP的扩增产物需紫外灯下观察或医院并不普及的浊度仪检测,前者结果容易受主观判断影响,而后者价格昂贵。而SAT-EV71采用全程闭管,荧光检测使用医院较普及的荧光定量PCR扩增仪,判断结果相对客观;(2)暂无文献报道LAMP-EV71在实验过程中可加入内标来控制假阴性。早先的SAT-TB也有1例假阴性的报道[ 7],因此,在SAT-EV71中加入了竞争性内标来可有效解决假阴性结果,从而提高了实验敏感度;(3) LAMP-EV71的终产物是DNA,高敏感性的扩增容易带来实验室污染的危险,而SAT-EV71的扩增产物是RNA,相对DNA在管外更容易降解,从而减少假阳性,增加了实验特异性。

总之,本研究建立的SAT-EV71方法快速、准确、敏感性高、特异性强,适合临床上对EV71感染的快速特异的病原学诊断。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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