引用本文
潘芬, 张泓. 多重聚合酶链反应在肺炎链球菌血清学分型中的应用. 29(11): 1089-1093
PAN Fen, ZHANG Hong. Application of multiplex polymerase chain reaction for detecting the serotypes ofStreptococcus pneumonia . Labratory Medicine, 29(11): 1089-1093  
Permissions
Copyright©2014, 《检验医学》编辑部
《检验医学》编辑部版权所有
多重聚合酶链反应在肺炎链球菌血清学分型中的应用
潘芬, 张泓
上海交通大学附属儿童医院检验科,上海 200040

作者简介:潘芬,女,1988年生,硕士,主要从事细菌耐药机制及分子流行病学研究。

通讯作者:张泓,联系电话:021-62474880-82301。

摘要

肺炎链球菌是儿科感染中常见的病原菌之一。基于荚膜多糖抗原的特点,传统荚膜肿胀实验可将肺炎链球菌分为46个血清群,90多种血清型。近年来随着分子生物学技术的发展,多重聚合酶链反应(MP-PCR)技术不断成熟并逐步代替常规的荚膜肿胀实验,用于血清学分型。该技术具有简便快速、成本相对较低等优点,能有效的监测临床上肺炎链球菌流行血清型。

关键词: 肺炎链球菌; 多重聚合酶链反应; 血清型
中图分类号:R446.1 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2014)11-1089-05
Application of multiplex polymerase chain reaction for detecting the serotypes ofStreptococcus pneumonia
PAN Fen, ZHANG Hong
Department of Clinical Laboratory, Children's Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200040, China
Abstract

Streptococcus pneumoniae is one of common pathogens causing pediatric infections. Owing to the characteristic of capsular polysaccharide,Streptococcus pneumoniae can be differentiated into 40 serogroups and more than 90 serotypes by conventional capsular quellung reaction. Recently, with the development of molecular biological techniques, multiplex polymerase chain reaction (MP-PCR) gradually replaces the conventional capsular quellung reaction, which is used to detect the serotypes ofStreptococcus pneumoniae. Furthermore, MP-PCR has the advantages of easy and rapid operation and low costing, which could provide the basis for monitoring the prevalent serotypes ofStreptococcus pneumoniae in clinic.

Keyword: Streptococcus pneumoniae; Multiplex polymerase chain reaction; Serotype
引言

肺炎链球菌( Streptococcus pneumoniae, SP)是临床上常见的病原菌之一,主要见于儿童及老年人感染,能引起鼻窦炎、中耳炎、支气管炎、肺炎等非侵袭性感染和败血症、脑膜炎、腹膜炎、关节炎等侵袭性感染,发病率和病死率均较高。根据荚膜多糖(capsular polysaccharides, CPS)免疫原性的不同,可将SP分为46个血清群和90多种血清型[ 1]。目前由丹麦国家血清研究院(statens serum institut,SSI)提供的荚膜肿胀法和乳胶凝集法是检测SP血清型的金标准[ 2],但因其抗血清价格昂贵,对结果判断主观性强,不能自动化及批量检测,临床上不常规开展,一般用于科学实验。近年来,SP血清型分型的检测出现了多种分子生物学分型技术,例如多重聚合酶链反应(multiplex PCR, MP-PCR)[ 3]、荚膜序列分型(capsular sequence typing, CST)[ 4]、基因芯片等[ 5],其中MP-PCR应用较为广泛,能够更简便快速有效的检测SP血清型。本综述主要从MP-PCR在SP血清分型中的应用等几个方面进行阐述。

一、分子生物学分型技术的基础

SP是具有荚膜的革兰阳性球菌,致病性强。在众多致病因子中,CPS是SP主要毒力因子。最先是由单糖磷酸酯从核糖二磷酸糖转移到膜相关脂质载体而合成的,然后通过连续性转移更多的单糖而形成脂连接重复单元,并经过可重复单位转运子或翻转酶的作用转移到胞质膜的外表面,聚合形成成熟的CPS,并黏附于肽聚糖上[ 6],其作用是能抵抗吞噬细胞的吞噬,有利于细菌在宿主体内定居并繁殖。

CPS抗原具有型特异性,是SP血清学分型的基础。90多种血清型中,血清型3和37的CPS是由合酶通路(synthase pathway)合成,而其它血清型的CPS则全是利用 wzg、 wzh、 wzd及 wze(称为 cps A B C D)基因并通过Wzx/Wzy依赖通路而合成的[ 7, 8, 9]。同时,与Wzx/Wzy依赖通路相关的染色体基因 cps位于 dexB和 aliA基因之间[ 6],其中 dexB和 aliA基因并不参与CPS的合成。但是 cps位点基因组编码重复单位形成的酶(初始葡萄糖磷酸化转移酶及其它用于连接的酶),参与其中的过程[ 6]。在所有 cps基因组的5'端存在启动和调节基因 wzg、 wzh、 wzd、 wze,为高度保守序列,具有同源性,可作为血清分型的内控基因。同时,在多数 cps基因组中,第五个基因 wchA( cpsE)是葡萄糖磷酸转移酶的启动基因,负责把葡萄糖磷酸连接到脂质载体[ 6]。另外, cps位点基因组内还包括多糖聚合酶基因( wzy)和翻转酶基因( wzx)位于基因组下游,伴有不同的糖基转移酶、乙酰基转移酶、和修饰酶等[ 6], wzy与 wzx基因是具有血清型特异性的。

由上可知, cap/cps是CPS血清型相关基因组,几乎存在于所有SP的染色体上,是成簇出现的[ 10],其中血清型3的合成酶基因( wch E)是位点 cps位点内部,而合成血清型37的 tts基因位于染色体的 cap位点外。但不同血清型别、血清群之间SP的 cap/cps的结构和组成有所不同[ 10]。2006年,Bently等[ 6]完成了90种血清型SP的 cps位点基因序列的测序工作,并将其公开在网站上(http://www.sanger.ac.uk/Proiects/S.pncumoniae/CPS/),为SP血清分型提供了有效的证据,使得MP-PCR血清分型顺利进行。

二、MP-PCR的原理

所谓MP-PCR,又称复合PCR.它是在同一反应体系中采用两对或以上不同引物,同时扩增出多个序列的方法。由于每对引物扩增的片段长短不同,可用相应方法(如电泳)加以分析。其反应原理、反应试剂和操作过程与常规PCR相同,但其大大节约了人力、时间、试剂。目前该方法广泛用于多种病原微生物(金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎支原体等)的检测或鉴定,以及某些遗传病及癌基因的分型鉴定。

MP-PCR用于血清学分型的原理是由于SP不同血清型的基因序列不同,研究者可从基因数据库(如NCBI数据库)中搜索各血清型的基因序列,并通过相关引物软件来设计血清型/群特异性的PCR引物;同时根据SP流行血清型而设计每个反应体系的血清型引物对数及浓度,并对反应条件不断探索优化,减少错配的发生;然后进行MP-PCR反应,根据某一血清型的引物与样本DNA特异性结合,从而扩增出一定长度的小片断,电泳后根据特异性条带的大小而判定为相应血清型。

三、MP-PCR技术在SP血清学分型中的发展

2003年,Elliot R等[ 11]利用半自动MP-PCR对93株临床上分离到的SP进行5种血清型(1,3,14,19F,23F)及3个血清组(6,19,23)分析,结果发现了所有血清型均能被准确检测到,特异性为100%,敏感性为99%,其中32株为疫苗覆盖的5种血清型。同年,Brito等[ 12]也根据血清型之间的PCR产物大小及引物间的兼容性设计了G1-G6反应组对446株菌株进行初步筛选,然后根据所对应的特异性反应组再次MP-PCR分析(采用尽可能少的PCR次数),结果显示294株(65.9%)成功被分型,152株因多重体系中未涵盖该特异性引物而无法分型。

在上述基础上,Pai等[ 3]在2006年首次提出一个概念“连续性MP-PCR”,其原理是根据美国当前侵袭性CPS流行血清型将引物分成7组(Reaction 1-7),Reaction 1-3包含目前最为常见的血清型,Reaction 4-7为较为少见的血清型;每组中含有4对特异性血清引物及cps-A内控,从上而下依次对SP菌株进行MP-PCR鉴定,若该菌株能扩增出特异性条带,即成功鉴定,无需进行下一个反应,反之则进行下一个反应。另外,分析结果显示421株CPS中,229株(54.3%)在前三个反应中能被特异性分型,与常规方法分析结果一致。该技术不断被应用,作为新型分型技术,对SP血清型的监测具有重要的意义。

由于血清群/型可随时间、地点、年龄不同而变化,研究者根据当地SP流行血清型情况不断修改并优化MP-PCR[ 13, 14]。其中Siira等[ 15]采用MP-PCR技术与荚膜肿胀实验相结合鉴定血清型,取长补短,提高血清分型阳性率,证明98.8%(168/1 701)菌株准确分型,并能成功用于临床常规血清分型。此外,许多MP-PCR衍生技术不断涌现,如实时定量MP-PCR[ 16]、MP-PCR反向线性杂交技术(mPCR/RLB)[ 17]。目前,据美国疾病预防控制中心(CDC)报道,MP-PCR技术已能对40种血清型进行准确分型[ 18] (http://www.cdc.gov/ncidod/biotech/strep/pcr.htm)。

四、MP-PCR技术的应用
1.MP-PCR用于监测当前流行血清型

多价SP蛋白结合疫苗的选择取决于当地临床上流行SP血清型,尤其是侵袭性SP血清型分布情况。Pai等[ 3]利用MP-PCR技术分析2002至2003年421株侵袭性SP菌株,结果表明常见的血清型是6A/B、19A、3、4;欧洲爱尔兰地区[ 19],2007至2008年分离于中耳炎患者的SP血清型以3、19F、14、6A多见,共占68%,而西班牙地区[ 20],以19A、16F、15B为主;拉丁美洲[ 21]2000至2005年侵袭性SP数据显示以14、6B、1、5常见;2003至2006年非洲地区为1、6A/B、5、23F、14[ 22];国内北京地区分析的39株SP中,发现21株来自脑脊液/血液的常见血清型为14、19A、23F、18C,18株来自痰液的常见血清为19F、23F、19A、3[ 23]。了解当前血清型,有助于监测SP流行病学特征,发现新型血清型。

2.MP-PCR用于评价疫苗所覆盖率及疫苗应用前后血清型的变化

目前临床上多见的疫苗为PCV-7、PCV-13等,有研究报道疫苗应用后出现了“血清型替代现象”[ 24],且关于疫苗的有效性仍需要进一步了解。Rima Hanna-Wakim等[ 25]报道了PCV7、PCV-10、PCV-13疫苗的覆盖率分别为41.4% (106例),53.9% (138例) 、67.2% (162例) 。Dos等[ 26]针对PCV-10应用前、后的血清型分析,PCV-10应用前,血清型14多见,5、6B次之;应用之后疫苗覆盖的血清型下降,19A增多,7F为最常见。Pak-Leung Ho等[ 27]利用MP-PCR技术监测PCV-7应用前后香港地区血清型的变化情况,结果显示侵袭性肺炎球菌感染的<5岁的儿童PCV-7覆盖率从89.5%降为65.7%,血清型14下降(36%15.7%),而19A则增加(0%12.9%)。另1份研究报告表明PCV-7应用后,鼻黏部SP携带率从12.8%降为8.6%,非PCV-7血清型(19A、6A、6C、23A、15B)比例增加[ 28]。监测疫苗应用前后血清型变化情况,可为新疫苗的研发提供有效的依据。

五、MP-PCR技术的特点

相对于SSI提供的荚膜肿胀试验价格昂贵、操作繁琐,MP-PCR能广泛地应用于许多实验室,更具有优势:(1)方法简便快速,仅需要提取DNA模板,几次PCR反应并电泳即可判断结果,反应时间短,可直接采用临床标本进行分型,而常规荚膜肿胀实验则需要新鲜纯分的菌株。1份研究显示分析219株SP常规需要2 466次凝集反应,而仅需要688次MP-PCR即可鉴定[ 29];(2)价格便宜,易于推广。据文献统计[ 12],SSI抗血清分型方法分析一个样本所需的花费为$28.90,而MP-PCR仅需$1.8,明显降低其成本与耗材,能广泛地应用于更多的实验室,甚至临床样本的血清型检测,提高药物治疗的有效性;(3)无主观因素的影响,对操作人员要求相对较低,MP-PCR是根据引物与模板之间特异性结合而发生的,其具有特异性(除发生交叉反应的血清型之外);(4)敏感性及特异性较高,据文献报道MP-PCR敏感性为100%,特异性为99%[ 11],同时MP-PCR可对荚膜阴性的SP进行分型,发现两种血清型共同存在的现象[ 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30],也能用于常规血清分型敏感性不高的菌株的血清分型[ 29]。

但MP-PCR技术仍存在一定的缺陷:(1)SP血清型有90多种,目前公布的血清型序列仅为40多种,仍有50多种血清型无法分型,需采用SSI提供的血清型分型确定;(2)MP-PCR鉴定结果与常规抗血清分型结果存在不一致性[ 3]。有些血清之间存在交叉反应,例如6A与6B,7F与7A血清型之间存在相似性[ 31],在MP-PCR过程中无法将两种型别进行区分,此时需要重新设计引物或采用SSI提供的抗血清进行分型,进一步确认。

六、展望

综上所述,由于SP的疫苗是基于血清型分布情况而研发,加强对血清型的监测刻不容缓。传统的荚膜肿胀实验因需要昂贵的抗血清和受主观因素等影响,无法用于临床上大样本的流行病学分析,限制了其应用。而MP-PCR这一分子生物学技术的提出,解决了上述的问题,具有快速、简便、可靠等优点,更适用于SP血清型筛查及流行病学调查,同时,MP-PCR提出并不断被优化,能更好地应用于临床血清型分析,为疫苗的研发及克隆传播提供有效的依据。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] Mavroidi A, Aanensen DM, Godoy D, et al. Genetic relatedness of the Streptococcus pneumoniae capsular biosynthetic loci[J]. J Bacteriol, 2007, 189(21): 7841-7855. [本文引用:1] [JCR: 3.194]
[2] Sørensen UB. Typing of pneumococci by using 12 pooled antisera[J]. J Clin Microbiol, 1993, 31(8): 2097-2100. [本文引用:1] [JCR: 4.068]
[3] Pai R, Gertz RE, Beall B. Sequential multiplex PCR approach for determining capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae isolates[J]. J Clin Microbiol, 2006, 44(1): 124-131. [本文引用:4] [JCR: 4.068]
[4] Elberse KE, van de Pol I, Witteveen S, et al. Population structure of invasive Streptococcus pneumoniae in the Netherland s in the pre-vaccination era assessed by MLVA and capsular sequence typing[J]. PLoS One, 2011, 6(5): e20390. [本文引用:1] [JCR: 3.73]
[5] Wang Q, Wang M, Kong F, el al. Development of DNA microarray to identify the Streptococcus pneumoniae serotypes contained in the 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine and closely related serotypes[J]. J Microbiol Methods, 2007, 68(1): 128-136. [本文引用:1] [JCR: 2.161]
[6] Bentley SD, Aanensen DM, Mavroidi A, et al. Genetic analysis of the capsular biosynthetic locus from all 90 pneumococcal serotypes[J]. PLoS Genet, 2006, 2(3): e31. [本文引用:6] [JCR: 8.517]
[7] Cartee RT, Forsee WT, Jensen JW, et al. Expression of the Streptococcus pneumoniae type 3 synthase in Escherichia coli. Assembly of type 3 polysaccharide on a lipid primer[J]. J Biol Chem, 2001, 276(52): 48831-48839. [本文引用:1] [JCR: 4.651]
[8] Dillard JP, Vand ersea MW, Yother J. Charac-terization of the cassette containing genes for type 3 capsular polysaceharide biosynthesis in Streptococcus pneumoniae[J]. J Exp Med, 1995, 18l(3): 973-983. [本文引用:1] [JCR: 13.214]
[9] Kolkman MA, van der Zeijst BA, Nuijten PJ. Diversity of capsular polysaccharide synthesis gene clusters in Streptococcus pneumoniae[J]. J Biochem, 1998, 123(5): 937-945. [本文引用:1] [JCR: 2.719]
[10] García E, Llull D, Muñoz R, et al. Current trends in capsular polysaccharide biosynthesis of Streptococcus pneumoniae[J]. Res Microbiol, 2000, 151(6): 429-435. [本文引用:2] [JCR: 2.889]
[11] Lawrence ER, Griffiths DB, Martin SA, et al. Evaluation of semiautomated multiplex PCR assay for determination of Streptococcus pneumoniae serotypes and serogroups[J]. J Clin Microbiol, 2003, 41(2): 601-607. [本文引用:2] [JCR: 4.068]
[12] Brito DA, Ramirez M, de Lencastre H. Serotyping Streptococcus pneumoniae by multiplex PCR[J]. J Clin Microbiol, 2003, 41(6): 2378-2384. [本文引用:2] [JCR: 4.068]
[13] Ahn JG, Choi SY, Kim DS, et al. Enhanced detection and serotyping of Streptococcus pneumoniae using multiplex polymerase chain reaction[J]. Korean J Pediatr, 2012, 55(11): 424-429. [本文引用:1]
[14] Iraurgui P, Torres MJ, Gand ia A, et al. Modified sequential multiplex PCR for determining capsular serotypes of invasive pneumococci recovered from Seville[J]. Clin Microbiol Infect, 2010, 16(9): 1504-1507. [本文引用:1] [JCR: 4.578]
[15] Siira L, Kaijalainen T, Lambertsen L, et al. From quellung to multiplex PCR, and back when needed, in pneumococcal serotyping[J]. J Clin Microbiol, 2012, 50(8): 2727-2731. [本文引用:1] [JCR: 4.068]
[16] Pimenta FC, Roundtree A, Soysal A, et al. Sequential triplex real-time PCR assay for detecting 21 pneumococcal capsular serotypes that account for a high global disease burden[J]. J Clin Microbiol, 2013, 51(2): 647-652. [本文引用:1] [JCR: 4.068]
[17] Zhou F, Kong F, Tong Z, et al. Identification of less-common Streptococcus pneumoniae serotypes by a multiplex PCR-based reverse line blot hybridization assay[J]. J Clin Microbiol, 2007, 45(10): 3411-3415. [本文引用:1] [JCR: 4.068]
[18] Pimenta FC, Gertz RE Jr, Roundtree A, et al. Rarely occurring 19A-like cps locus from a serotype 19F pneumococcal isolate indicates continued need of serology-based quality control for PCR-based serotype determinations[J]. J Clin Microbiol, 2009, 47(7): 2353-2354. [本文引用:1] [JCR: 4.068]
[19] Vickers I, O'Flanaqan D, Cafferkey M, et al. Multiplex PCR to determine Streptococcus pneumoniae serotypes causing otitis media in the Republic of Ireland with further characterisation of antimicrobial susceptibilities and genotypes[J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2011, 30(3): 447-453. [本文引用:1]
[20] Ercibengoa M, Arostegi N, Marimón JM, et al. Dynamics of pneumococcal nasopharyngeal carriage in healthy children attending a day care center in northern Spain. Influence of detection techniques on the results[J]. BMC Infect Dis, 2012, 12: 69. [本文引用:1] [JCR: 3.025]
[21] Castañeda E, Agudelo CI, Regueira M, et al. Laboratory-based surveillance of Streptococcus pneumoniae invasive disease in children in 10 Latin American countries: a SIREVA Ⅱ project, 2000-2005[J]. Pediatr Infect Dis J, 2009, 28(9): e265-e270. [本文引用:1] [JCR: 3.569]
[22] Morais L, Carvalho Mda G, Roca A, et al. Sequential multiplex PCR for identifying pneumococcal capsular serotypes from South-Saharan African clinical isolates[J]. J Med Microbiol, 2007, 56(Pt 9): 1181-1184. [本文引用:1] [JCR: 2.297]
[23] Zhang YJ, Chen YS, Wang ZW, et al. Serological and molecular capsular typing, antibiotic susceptibility and multilocus sequence typing of Streptococcus pneumoniae isolates from invasive and non-invasive infections[J]. Chin Med J (Engl), 2013, 126(12): 2296-2303. [本文引用:1]
[24] Weinberger DM, Malley R, Lipsitch M. Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination[J]. Lancet, 2011, 378(9807): 1962-1973. [本文引用:1] [JCR: 39.06]
[25] Hanna-Wakim R, Chehab H, Mahfouz I, et al. Epidemiologic characteristics, serotypes, and antimicrobial susceptibilities of invasive Streptococcus pneumoniae isolates in a nationwide surveillance study in Lebanon[J]. Vaccine, 2012, 30(Supple 6): G11-G17. [本文引用:1] [JCR: 3.492]
[26] Dos Santos SR, Passadore LF, Takaqi EH, et al. Serotype distribution of Streptococcus pneumoniae isolated from patients with invasive pneumococcal disease in Brazil before and after ten-pneumococcal conjugate vaccine implementation[J]. Vaccine, 2013, 31(51): 6150-6154. [本文引用:1] [JCR: 3.492]
[27] Ho PL, Chiu SS, Ang I, et al. Serotypes and antimicrobial susceptibilities of invasive Streptococcus pneumoniae before and after introduction of 7-valent pneumococcal conjugate vaccine, Hong Kong, 1995-2009[J]. Vaccine, 2011, 29(17): 3270-3275. [本文引用:1] [JCR: 3.492]
[28] Ho PL, Chiu SS, Chan MY, et al. Changes in nasopharyngeal carriage and serotype distribution of antibiotic-resistant Streptococcus pneumoniae before and after the introduction of 7-valent pneumococcal conjugate vaccine in Hong Kong[J]. Diagn Microbiol Infect Dis, 2011, 71(4): 327-334. [本文引用:1]
[29] Saha SK, Darmstadt GL, Baqui AH, et al. Identification of serotype in culture negative pneumococcal meningitis using sequential multiplex PCR: implication for surveillance and vaccine design[J]. PLoS One, 2008, 3(10): e3576. [本文引用:2] [JCR: 3.73]
[30] O'Brien KL, Millar EV, Zell ER, et al. Effect of pneumococcal conjugate vaccine on nasopharyngeal colonization among immunized and unimmunized children in a community- rand omized trial[J]. J Infect Dis, 2007, 196(8): 1211-1120. [本文引用:1] [JCR: 5.848]
[31] Jourdain S, Drèze PA, Vand even J, et al. Sequential multiplex PCR assay for determining capsular serotypes of colonizing S. pneumoniae[J]. BMC Infect Dis, 2011, 11: 100. [本文引用:1] [JCR: 3.025]