引用本文
赵卫卫, 彭攸, 李晓娇, 卢晓佳, 王玉平, 刘萃萃, 王璐璐, 冯景. EZH2基因3'非翻译区慢病毒载体构建及重组体筛选. 检验医学, 2013, 28(6): 511-515
ZHAO Weiwei, PENG You, LI Xiaojiao, LU Xiaojia, WANG Yuping, LIU Cuicui, WANG Lulu, FENG Jing. The construction of lentivirus-EZH2 3'UTR vector and the screening for its recombinant . Labratory Medicine, 2013, 28(6): 511-515  
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EZH2基因3'非翻译区慢病毒载体构建及重组体筛选
赵卫卫, 彭攸, 李晓娇, 卢晓佳, 王玉平, 刘萃萃, 王璐璐, 冯景
南方医科大学附属奉贤医院检验科,上海 201400
通讯作者:冯景,联系电话:021-57412836。

作者简介:赵卫卫,女,1986年生,硕士,技师,主要从事乳腺癌的发生、发展与miRNAs的相互关系研究。

基金:上海市自然科学基金(12ZR1426300)
摘要
目的 构建携带人EZH2 基因3'非翻译区(3'UTR)的慢病毒筛选载体并实现该重组体在人乳腺癌MCF-7中稳定整合,为下一步MicroRNAs(miRNAs)筛选奠定基础。方法 从组织中提取并用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出EZH2 基因3'UTR,构建携带EZH2基因3'UTR的重组慢病毒载体CTX-Lentivirus-EZH2 3'UTR,脂质体法将重组的慢病毒载体和包装载体混合物共转染工具细胞293T细胞,包装产生慢病毒颗粒。用裂解液裂解病毒颗粒,根据慢病毒载体上的CMV启动子表达量检测病毒滴度。用慢病毒颗粒感染乳腺癌MCF-7细胞后,通过嘌呤霉素筛选稳定整合的乳腺癌细胞MCF-7,用Real-Time PCR和Western blotting方法检测EZH2基因3'UTR是否整合入细胞MCF-7中。结果 PCR扩增检测阳性菌落和测序结果证实,EZH2 基因3'UTR成功定向克隆到慢病毒载体上。Real-Time PCR检测病毒滴度为4.3×109拷贝/mL。筛选稳定整合MCF-7细胞的最佳浓度为0.2μg/mL。重组慢病毒转导MCF-7后,Real-Time PCR和Western blotting方法分别检测EZH2基因3'UTR整合到乳腺癌细胞MCF-7基因组中。慢病毒感染实验组和对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 成功构建携带EZH2基因3'UTR慢病毒筛选载体,实现重组体在乳腺癌MCF-7细胞中稳定整合。
关键词: EZH2; 非翻译区; 慢病毒载体; MCF-7
中图分类号:Q503 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2013)06-0511-05
The construction of lentivirus-EZH2 3'UTR vector and the screening for its recombinant
ZHAO Weiwei, PENG You, LI Xiaojiao, LU Xiaojia, WANG Yuping, LIU Cuicui, WANG Lulu, FENG Jing
Department of Clinical Laboratory, Fengxian Hospital Affiliated to Southern Medical University,Shanghai 201400,China
Abstract
Objective To construct lentiviral vector carrying humanEZH2 3'untranslated region(UTR) and maintain its stable integration of recombinant in MCF-7 cells of breast cancer, and to lay the foundation for the further screening of MicroRNAs(miRNAs). Methods TheEZH2 3'UTR was extracted and amplified by real-time fluorescence quantitation polymerase chain reaction(RT-PCR), and was constructed into recombinant lentiviral vector, CTX-lentivirus-EZH2 3'UTR vector. The 293T cells were contransfected with the recombinant lentiviral vector together with lentivirus package plasmid to produce lentiviral particles by liposome method. Cracking liquid cracked virus particles, and virus titer was measured according to the expression level of CMV promoter. MCF-7 cells were infected with recombinant lentiviral vector. Puromycin was used to screen the stable MCF-7 cells. The RT-PCR and Western blotting were determined the integration ofEZH2 3'UTR into MCF-7 cells. Results EZH2 3'UTR was cloned in lentiviral vector. By RT-PCR, the virus titer reached to 4.3×109 copyies/mL. The optimal concentration for screening stable integration of MCF- 7 cells was 0.2 μg/mL. In infected MCF-7 cells, by RT-PCR and Western blotting, theEZH2 3'UTR mRNA was integrated into MCF-7 genome.The difference between the experimental group and the control group was significant(P<0.01). Conclusions EZH2 3'UTR lentiviral vector has successfully constructed and maintained stable integration in MCF-7 cells of breast cancer.
Keyword: EZH2 gene; Untranslated region; Lentiviral vector; MCF-7
引言

EZH2基因是人们新近认识的一种人类基因,定位于染色体7q35,是一种转录阻遏因子,可抑制抑癌基因的活性,具有促进多种肿瘤的转移特征[ 1, 2]。大量研究表明,乳腺癌发生、发展与 EZH2基因密切相关[ 3, 4, 5, 6]。进一步研究表明,miRNAs对 EZH2的表达有重要的调控作用[ 7, 8]。miRNA是一种不编码蛋白的单链小分子RNA,其通过完全或不完全地与靶mRNA的3'UTR互补结合,引起靶基因的翻译抑制或切割降解,从而调控基因的表达[ 9]。本研究尝试将 EZH2基因3'UTR序列定向克隆到慢病毒筛选载体上,构建携带 EZH2基因3'UTR的慢病毒筛选载体,在包装质粒的辅助作用下包装成慢病毒颗粒,并转染乳腺癌细胞株MCF-7,获得稳定表达EZH2 3'UTR的细胞株,为后续的筛选miRNAs奠定基础。

材料和方法
一、材料

293T细胞株、乳腺癌细胞株MCF-7(上海中科院提供);pMD19-T 载体(TaKaRa公司);CTX靶点筛选系统慢病毒表达载体及包装质粒(SBI公司);Taq DNA聚合酶、4×dNTP(Promega公司);DNA连接酶、限制性内切酶BamHI和EcoR I(TaKaRa公司);RNA提取试剂盒、质粒小量提取试剂盒、胶回收试剂盒(QIAGEN公司);Lipofecter脂质体转染试剂(碧云天公司);MarkerDL2000、低熔点琼脂糖(上海生物工程公司)。

二、方法

1. EZH2 3'UTR 重组筛选载体的构建 查询PubMed数据库( www.PubMed.com)查找人EZH2 mRNA序列,根据EZH2 3'UTR序列信息设计引物。引物序列 上游P5:5'-CT(保护碱基)GGATCC(划线部分为BamHI酶切位点)CATCTGCTACCTCCTCC-3',下游P3:5'- CA(保护碱基)GAATTC(划线部分为EcoRI酶切位点)GATTCAACAAGGACAAGTT-3'。抽提乳腺癌组织总RNA,进行逆转录PCR反应。反应条件为94 ℃预变性3 min,94 ℃变性30 s,55 ℃复性30 s,72 ℃延伸30 s,共35个循环。对CTX-Lentivirus空质粒和pMD19T-EZH2 3'UTR重组质粒分别用BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切,酶切产物在T4DNA连接酶作用下与16℃连接1h。转化感受态大肠杆菌,次日挑取菌落进行PCR,对于阳性菌落进行抽取质粒,以BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切进行重组质粒鉴定后送于上海生工生物工程公司进行测序。

2. 病毒颗粒的包装和生产 将对数生长期的293T细胞进行胰酶消化后,接种到6孔板中。用脂质体法将病毒包装pPACKH1-GAG、pPACKH1-REV、pVSV-G三质粒混合物(500 ng/μL) 7.5μL和CTX- EZH2'UTR慢病毒质粒(609 ng/μL)1.2μL共转染293T细胞,混匀后放回到5% CO2培养箱中。6h后,移去细胞上清,更换为5mL的DMEM完全培养基。收集转染72 h后的293T细胞上清,用Real-Time PCR对病毒进行滴度测定。CMV上游引物P5:5'-ACGTATTGTCATC-GCTATTACCAT-3',CMV下游引物P3:5'-TGGAAATCCCCGTGAGTCAAA-3',CMV探针:5'CGCTATCCACGCCCATTGATGTACTGCC-3'。以CMV上下游引物,以tubulin为内参进行定量PCR,检测病毒滴度。

3. 重组慢病毒感染MCF-7细胞阳性细胞株的筛选 将细胞接种于6孔板中,择合适的感染复数(MOI)值,加入适量的病毒,同时加入终浓度为10 μg/mL的polybrene增强病毒感染。感染24h后换成无病毒和polybrene的完全培养基继续培养。在感染前进行预实验,摸索最佳筛选药物浓度。感染72 h后收集细胞,将其置于含嘌呤霉素的完全培养基中筛选,并进行克隆和扩增。

4. PCR鉴定重组体在MCF-7细胞中的整合 收集经嘌呤霉素筛选的阳性细胞,提取基因组DNA。根据慢病毒载体上CMV启动子的序列设计引物,阳性细胞的基因组DNA为模板,进行PCR反应。反应体系:94 ℃预变性3 min,94 ℃变性30 s,60 ℃复性30 s,72 ℃延伸30 s,共33个循环。通过PCR鉴定EZH2 3'UTR与MCF-7细胞基因组整合量。

5. Western blotting检测慢病毒感染乳腺细胞株MCF-7后EZH2蛋白表达 以未感染EZH2 3'UTR的MCF-7乳腺癌细胞为对照组,细胞培养后,分别收获实验组和对照组细胞,加入组织细胞裂解液提取蛋白,配制10%的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶,上样量为20 μL,进行电泳。恒压80V至分离胶处后100V至电泳结束。200mA,1 h将蛋白电转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜,转膜结束后EZH2用含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭1 h,4 ℃封闭过夜。EZH2一抗工作浓度为1∶300,4 ℃过夜,actin一抗工作浓度为1∶200,室温3h。TBST洗膜10 min×3次;加入二抗,工作浓度为1∶300,室温反应2 h 30 min,TBST洗膜10 min×3次。加入化学发光底物,暗室压片,曝光后显影、定影。

三、统计学方法

用SPSS13.0软件包进行统计学分析,数据用 ±s表示,数据符合正态分布用 t检验, P<0.05表示差异有统计学意义。

结果
一、目的片段EZH2 3'UTR的获取

经PCR扩增后,用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行产物鉴定,目的片段大小为275bp,与预期扩增的基因片段大小一致,见 图1。

'>图1 目的片段EZH2 3'UTR凝胶电泳结果 注:M为DNA Marker;N为阴性对照;1为RT-PCR产物

二、克隆载体pMD19-T-EZH2 3'UTR的构建及鉴定

目的片段EZH2 3'UTR与克隆载体pMD19-T通过连接酶连接后,转化大肠杆菌后,次日随机挑取6个菌落进行PCR鉴定,可见除1个克隆未出现目的条带外,其余5个均出现目的条带,大小为275bp,与预期片段大小相符,见 图2。BamHⅠ、EcoRⅠ双切酶克隆载体pMD19-T—EZH2 3'UTR后,在电泳下可见275bp处有目的条带,与预期片段大小相符,见 图3。

'>图2 pMD19-I-EZH2 3'UTR菌落PCR扩增结果 注:M为DNA Marker;N为阴性对照;1~6为EZH2 3'UTR克隆

'>图3 pMD19-T-EZH2 3'UTR双酶切鉴定 注:M为DNA Marker;1和2为BamH I和EcoR I双酶切pMD 19-T-EZH1 3'UTR

三、重组慢病毒筛选载体CTX-Lentivirus-EZH2 3'UTR构建及鉴定

从AMP+的LB平板上随机挑克隆,进行菌落PCR鉴定,对于阳性重组子用BamHⅠ、EcoRⅠ进行双酶切鉴定,在约10.2Kb处可见线性慢病毒质粒和275bp的目的条带,见 图4,测序结果显示目的片段已经克隆到慢病毒载体中。

'>图4 CTX-Lentivirus-EZH2 3'UTR双酶切鉴定 注:M为DNA Marker;1为BamH I和EcoR I双酶切载体CTX-Lenticirus-EZH2 3'UTR

四、重组慢病毒颗粒滴度测定

对病毒进行裂解后用裂解的病毒上清作为模板,以CMV的上下游P3、P5为引物,进行实时定量PCR,做复管得到CMV1和CMV2的值为1.6×107拷贝/mL和2.1×107拷贝/mL,通过病毒滴度计算公式得到:病毒滴度为 4.3×109拷贝/mL。

五、重组慢病毒感染乳腺癌MCF-7细胞株后整合量的鉴定

经梯度摸索筛选稳定整合MCF-7细胞的最佳浓度为0.2μg/mL。经Real-Time PCR检测,实验组病毒整合入细胞基因组的值与对照组比较,差异有统计学意义( P<0.01)。表明重组EZH2 3'UTR慢病毒载体在MCF-7细胞中很好地与细胞基因组整合,见 图5。

图5 MCF-7细胞中重组慢病毒载体的整合量鉴定 注:与对照组比较, P<0.01

六、Western blotting检测乳腺癌细胞MCF-7中EZH2蛋白表达

Western blotting检测显示,在EZH2慢病毒感染实验组中,EZH2蛋白呈高表达,而没有感染EZH2 3'UTR的MCF-7乳腺癌细胞对照组,则少量表达EZH2蛋白,见 图6。

图6 转染慢病毒后EZH2蛋白的表达 注:1为对照组;2为病毒感染实验组

讨论

近年研究发现表观遗传调控因子PcG蛋白(polycomb group proteins)在乳腺癌的发生、发展过程中起重要作用[ 10],其核心成分EZH2蛋白广泛受到人们关注。EZH2通过催化组蛋白H3氨基末端的第27位赖氨酸(H3K27)发生三甲基化[ 11],促进或维持染色体的转录抑制状态,从而沉默癌组织中的抑癌基因的表达[ 12]。Raaphorst 等[ 13]研究发现,在浸润性导管癌EZH2表达明显增加, 表明EZH2是肿瘤发生发展的早期阶段的分子事件,直接参与了乳腺癌的演变过程。 EZH2高表达机制尚不清楚,但大量研究表明miRNAs对EZH2的表达有重要的调控作用[ 7, 8]。miRNAs 可通过与EZH2 基因的3'端非翻译区形成碱基配对抑制其表达。构建3'非翻译区慢病毒筛选载体为深入了解EZH2与miRNAs相互的关系显得非常必要。

慢病毒载体是以人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)来源的一种病毒载体[ 14, 15],与腺病毒相比,其具有可感染分裂细胞及非分裂细胞,转移片段容量较大,目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点[ 15, 16] 。本实验所选择的是长末端重复序列(LTR)缺失的慢病毒载体,经该载体包装产生的病毒颗粒属于假型病毒,即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞,也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒[ 17]。利用成功构建的 EZH2基因3'非翻译区慢病毒筛选载体,将目的片段 EZH2基因3'非翻译区整合到MCF-7的基因组中,经Real-Time PCR检测证实,目的片段在乳腺癌MCF-7中稳定整合。同时Western blotting检测显示,在EZH2慢病毒感染实验组中,EZH2蛋白呈高表达,而没有感染EZH2 3'UTR的空MCF-7细胞对照组,则低量表达EZH2蛋白,且该结果与Kleer等[ 18]的研究结果基本一致。

本研究成功构建人 EZH2基因3'非翻译区慢病毒筛选载体,并感染乳腺癌细胞MCF-7,使其在乳腺细胞中稳定整合,为miRNAs筛选提供理想的病毒载体,同时该慢病毒载体带有荧光报告系统,通过荧光报告基因分析,可以很好实现miRNAs与 EZH2 基因的3'端非翻译区的功能验证。

The authors have declared that no competing interests exist.

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