引用本文
李俐, 蒋燕群, 沈建雄, 薛志忠. 多重耐药因子A在临床菌株中的检测与分析. 2013, 28(4): 259-262
LI Li, JIANG Yanqun, SHEN Jianxiong, XUE Zhizhong. Detection and analysis of the multi-drug resistant regulator A in the clinical isolates. Labratory Medicine, 2013, 28(4): 259-262  
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多重耐药因子A在临床菌株中的检测与分析
李俐1, 蒋燕群2, 沈建雄1, 薛志忠1
1． 上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院检验科,上海 200437
2． 上海交通大学附属第六人民医院检验科,上海 200233

通讯作者：薛志忠,联系电话：021-65161782-2601。

作者简介：李俐,女,1983年生,硕士,技师,主要从事细菌耐药性研究。

摘要
目的调查大肠埃希菌临床菌株中多重耐药因子A （MarA）的表达情况,并分析其与第3、4代头孢菌素耐药的关系。方法随机抽取2003至2009年间大肠埃希菌49株,采用实时定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测外膜孔通道蛋白F（OmpF）的反义RNA-F因子（MicF）、主动外排系统AB（AcrAB）和MarA的相对表达量,纸片扩散法检测抗菌药物的敏感性。结果 49株大肠埃希菌中,7株（14．29％）AcrAB转录水平上调;13株（26．53％）膜孔蛋白MicF转录水平上调;11株（22．45％）MarA转录水平上调;3种耐药因素同时升高的有2株。49株大肠埃希菌对头孢噻肟、头孢他啶和头孢吡肟的耐药率依次为79．59％、75．51％和51．02％,其中AcrAB表达升高组对此3种抗菌药物的耐药率依次为100．00％、100．00％和57．14％,MicF表达升高组为80．00％、86．67％和53．33％,MarA表达升高组为75．00％、100．00％和58．33％,3种耐药因素同时存在时耐药率则均为100．00％。结论 MarA在大肠埃希菌临床菌种中起到一定的调控AcrAB和膜孔蛋白MicF的作用,当MarA同时调控二者高表达时可引起耐药率大幅升高。

关键词: 多重耐药因子A; 反义RNA-F因子; 外排泵; 大肠埃希菌
中图分类号:R446．5 文献标志码:A 文章编号:1673-8640（2013）04-259-04
Detection and analysis of the multi-drug resistant regulator A in the clinical isolates
LI Li1, JIANG Yanqun2, SHEN Jianxiong1, XUE Zhizhong1
1．Department of Clinical Laboratory,Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine,Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 200437,China
2．Department of Clinical Laboratory,Shanghai Sixth People#cod#x02032;s Hospital,Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200233,China
Abstract

Objective To detect the expression of multi-drug resistant regulator A （MarA） inEscherichia coli,and to analyze the relationship of MarA with the resistance to 3rd and 4th generation cephalosporin． Methods A total of 49 isolates ofEscherichia coli between 2003 and 2009 were collected randomly． Real-time quantitation reverse transcription polymerase chain reaction （RT-PCR） was used to detect the expression levels of anti-putative outer membrane porin F protein （OmpF） antisense RNA-F （MicF）,efflux pump AB （AcrAB） and MarA． The antibiotic sensitivity was also analyzed by disk diffusion method． Results Among the 49 isolates ofEscherichia coli,7 of 49 isolates （14．29％） had high AcrAB transcription level,13 of 49 isolates （26．53％） had MicF transcription level,11 of 49 isolates （22．45％） had high MarA transcription level,and 2 isolates had the 3 resistant factors simultaneously with increasing level． The resistance rates to cefotaxime,ceftazidime and cefepime were 79．59％, 75．51％ and 51．02％． The increasing expression level of AcrAB group showed that the resistance rates to these 3 antibiotics were 100．00％,100．00％ and 57．14％,respectively． The increasing expression level of MicF group showed that the resistance rates to these 3 antibiotics were 80．00％,86．67％ and 53．33％,respectively． The increasing expression level of MarA group showed that the resistance rates to these 3 antibiotics were 75．00％,100．00％ and 58．33％,respectively． The resistance rate increased to 100．00％,when all the 3 resistant factors existed simultaneously． Conclusions MarA plays an important role in regulating the expressions of AcrAB and MicF． The increasing expression levels of AcrAB and MicF regulated by MarA will lead to high resistance rate to antibiotics．

Keyword: Multi-drug resistant regulator A; Antisense RNA-F; Efflux pump; Escherichia coli
引言

多重耐药因子A（MarA）蛋白是一种多功能蛋白,可以在体内或体外加速基因转录并编码不同功能的蛋白质。有分析显示,MarA可以间接调控大肠埃希菌中60多个基因的表达,其中能够被直接激活的基因大约有40个[ 1]。而对于大肠埃希菌的外膜孔通道蛋白F（ ompF）基因的调控就属于间接调控,MarA可以激活反义RNA-F因子（MicF）的转录[ 2],而 micF基因的产物是一个反义RNA,此RNA可以干扰 ompF基因的表达,从而降低大肠埃希菌的外膜孔通道蛋白的表达量,因此MarA可以双向调控大肠埃希菌外膜孔的通透性,一方面使外膜孔通道蛋白的通透性下降,另一方面使外排泵的外排作用加强,这样就可以使有害于细菌的抗菌药物等难于在细菌体内发挥作用,因此就可以产生多重耐药的状况。本研究对临床分离的大肠埃希菌MarA进行分析并探讨其与第3、4代头孢菌素的耐药关系,以期待发现更有利于控制细菌耐药的因素。

材料和方法
一、材料

1． 菌株 随机收集上海市第六人民医院2003至2009年部分大肠埃希菌49株。

2． 试剂 药物敏感性纸片均购自Oxoid公司;聚合酶链反应（PCR）扩增试剂盒、逆转录（RT）-PCR试剂盒、实时定量PCR试剂盒均购自大连宝生物工程有限公司;细菌总RNA提取试剂盒购自天根生物有限公司;引物由上海生工公司和上海英骏公司合成。

3． 仪器 基因扩增仪（Eppendorf）,WALKA-WAY- 40微生物鉴定药物敏感性系统（Dada-Bering,Sacramento）,实时荧光定量PCR仪（LightCycler Real Time PCR扩增仪,罗氏）。

二、方法

1． 实时定量RT-PCR 用实时定量 RT-PCR 分别检测大肠埃希菌主动外排系统AB（ acrAB）、 micF和 marA的转录水平,引物见 表1。（1） 提取细菌总RNA。完全按照天根生物有限公司细菌总RNA提取试剂盒的说明书进行操作,主要步骤包括： 收集菌体,裂解细菌,去除蛋白质和DNA,溶解并收集总RNA,测RNA浓度;（2） 反转录。将RNA反转录成cDNA, 按照试剂盒说明书配置10 μL反应体系,在37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s 的条件下进行反应,反应产物做为模板进行下一步实时定量PCR;（3） 实时定量PCR。参照说明书配置20 μL反应溶液,使用说明推荐的两步法反应程序。步骤1 ：95 ℃ 30 s 20 ℃／s 1个循环 ; 步骤2： 95 ℃ 5 s 20 ℃／s、60 ℃ 20 s 20 ℃／s 40个循环。 以16S rRNA为内参,每份标本重复2次取均值,并设空白对照;（4） 以大肠埃希菌（ATCC 25922） 为标准对照,参照参考文献[3]推荐的方法进行分析。以大肠埃希菌（ATCC 25922）的外膜孔通道蛋白和MicF转录水平为基准,临床菌株与其比对。其中域值循环差（ΔCt）=目的基因Ct值–内参Ct值,标本域值循环差（ΔΔCt）=临床菌株目的基因Ct值–标准菌株目的基因Ct值;2-ΔΔCt为与标准菌株相比cDNA的含量,即为与标准对照转录水平的比值。

表1 OmpF、MicF RT-PCR引物

2． 药物敏感性试验 将试验菌株稀释至0．5麦氏单位后均匀涂布于水解酪蛋白胨（MH）琼脂平板,药物敏感性纸片贴于平板上,结果判定严格按照美国临床实验室标准化协会（CLSI）2009年制订的规则及标准判定,并检测最低抑菌浓度（MIC）。

结果
一、AcrAB RT-PCR结果

对49株大肠埃希菌进行AcrAB的RT-PCR检测,AcrAB表达量升高7株,其中3株同时有MarA表达水平升高。

二、MicF RT-PCR结果

49株大肠埃希菌中13株MicF表达水平升高,其中10株同时有MarA表达水平升高。

三、MarA RT-PCR结果

49株大肠埃希菌中MarA表达水平升高11株,其中2株菌同时有AcrAB和MicF表达水平升高。

四、药物敏感性试验结果

49株大肠埃希菌对头孢噻肟、头孢他啶和头孢吡肟的耐药率分别为79．59％、75．51％和51．02％,MarA表达升高组使头孢他啶和头孢吡肟的耐药率有所升高,当3种耐药机制同时存在时可大大提高细菌的耐药率。见 表2。

表2 试验菌株对第3、4代头孢菌素的耐药率（％）
讨论

Mar是多重耐药的简称,其调控基因的位点由 marRAB操纵子及 marC组成,其中 marC和 marB基因编码的蛋白功能未知;MarA在细胞内的表达量受控于MarR的调节[ 4];MarO有2个独立的DNA结合位点,可以分别结合MarA和MarR。MarA是转录激活子AraC家族的一员,可以激活自身的转录,同时有大量的 mar调节子基因位于靶基因的启动子附近,MarA就通过结合到靶基因的启动子附近的20 bp的DNA序列来激活基因的表达,称这种可被MarA结合的DNA序列为“marbox”[ 5]。重要的是, acrAB的启动子位于 marbox附近,这样MarA就可以结合并启动其转录[ 3],也有报道已证实这种说法,其结果就是大肠埃希菌的外排泵转录被激活,外排泵高表达[ 6]。除此之外,MarA的过表达也被证明可以引起AcrAB-TolC泵的组成成分TolC的过度合成,以此也有学者推论在 tolC基因的上游存在着 marbox[ 7]。

MarA蛋白的功能区由2个独立的HTH DNA结合域构成,这2个DNA结合域又是由一个长长的螺旋连接[ 5]。由于典型的HTH构型仅可以识别6 bp的碱基,而一个启动子序列至少有11~12 bp的碱基序列才可被DNA结合蛋白特异性识别,因此MarA蛋白具有2个HTH构型[ 8],只有2个HTH构型同时结合于一个碱基序列才可以起到激活的作用。

作为 marA基因的下游调控子,大肠埃希菌的 micF基因编码一个93个核苷酸的非翻译转录子[ 9]。 micF RNA序列可以部分与 ompF mRNA相互补,形成RNA-mRNA双聚体结构,而此结构中包含有 ompF的转录起始位点,从而导致 ompF mRNA无法翻译成蛋白[ 10],用这种方式调控着外膜孔通道蛋白OmpF的表达水平。反义RNA不仅在大肠埃希菌中有被发现,在沙门菌属、肺炎克雷伯菌属和黏质沙雷菌中也有报道[ 2]。在临床菌株中,MicF对于大肠埃希菌的调控作用已有证明,其可以调控外膜孔通道蛋白的表达,从结果来看,试验组的MicF转录水平普遍高于对照组[ 11],说明MicF通过干扰外膜孔通道蛋白的表达对细菌耐药起着调控作用。

大肠埃希菌是发现药物外排泵非常多的一种细菌,但是在其约30种外排泵中AcrAB-TolC外排泵是最主要的[ 12],这也是MarA的下游调控子。此外排泵的高表达并非自发式的,而是受许多正向和负向调控基因的调控,如正向调节因子MarA,负向调节因子AcrR。 acrR突变与AarA表达增高均可引起大肠埃希菌AcrAB表达增加[ 12]。

从本研究结果来看,MarA作为大肠埃希菌的多重耐药因子起到双重的调控作用,可引起细菌的耐药程度大幅度升高,同时试验结果也显示,当多重耐药调控因子MarA表达量升高时,外排泵AcrAB表达升高的有3株,而外膜孔通道蛋白反义RNA-MicF升高的有10株,即MarA对MicF的调控性高于外排泵,这也验证了外排泵是由3个结构组成,MarA只调控TolC这一个结构。细菌耐药问题的日益严峻,一方面警示人们抗菌药物的滥用会导致严重的后果,另一方面也迫使相关人员加快抗菌药物研发工作。细菌耐药机制的研究给我们的新药研发提供理论基础,从多方面入手解决问题。

The authors have declared that no competing interests exist.

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