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娄轶群, 褚维, 宋黎黎, 王宇, 劳宝法. 人感染H7N9禽流感监测病例中分离到一株A型呼吸道合胞病毒. 28(12): 1137-1139[LOU Yiqun, CHU Wei, SONG Lili, WANG Yu, LAO Baofa. A strain of RSV-A isolated from the monitoring specimens of avian influenza A (H7N9) virus. 上海检验医学, 28(12): 1137-1139]  
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人感染H7N9禽流感监测病例中分离到一株A型呼吸道合胞病毒
娄轶群, 褚维, 宋黎黎, 王宇, 劳宝法
上海市黄浦区疾病预防控制中心,上海 200023

娄轶群,女,1985年生,学士,技师,主要从事病原微生物实验室检测和研究。

劳宝法,联系电话:021-63013388。

摘要
目的

对H7N9型禽流感病毒(简称H7N9病毒)监测病例进行病原学检测,以明确呼吸道感染的诊断与鉴别诊断。

方法

采用多重逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)对H7N9病毒进行监测的同时对22种呼吸道常见病原体核酸进行检测,并对检测到的病原体进行分离鉴定。

结果

在一例重症肺炎患者的H7N9病毒监测标本中检出A型呼吸道合胞病毒(RSV-A),并利用人胚肺成纤维细胞(MRC-5)对该标本进行了病毒分离,成功分离到了一株RSV-A。

结论

多重RT-PCR能同时对22种呼吸道病原核酸进行检测,有助于疫情的及时诊断和控制。RSV-A的成功分离为呼吸道合胞病毒的进一步研究打下基础。

关键词: H7N9型禽流感病毒; 呼吸道合胞病毒; 人类感染; 多重逆转录聚合酶链反应
中图分类号:R446.1 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2013)12-1137-03
A strain of RSV-A isolated from the monitoring specimens of avian influenza A (H7N9) virus
LOU Yiqun, CHU Wei, SONG Lili, WANG Yu, LAO Baofa
Huangpu Center for Disease Control and Prevention,Shanghai 200023,China
Abstract
Objective

To detect and diagnose respiratory pathogens in the monitoring specimens of avian influenza A (H7N9) virus.

Methods

Nucleic acids of 22 kinds of respiratory pathogens were determined by multiple reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Relative respiratory pathogens were isolated and indentified.

Results

Among the monitoring specimens of avian influenza A (H7N9) virus, nucleic acid of respiratory syncytial virus A (RSV-A) was determined from a severe pneumonia illness patient. The specimen was isolated by MRC-5, and 1 strain of RSV-A was isolated successfully.

Conclusions

Multiple RT-PCR could test 22 kinds of respiratory pathogens simultaneously and contributes to diagnose and control the epidemic situation. The isolation of RSV-A would provide a foothold for the further research of respiratory syncytial virus.

Keyword: Avian influenza A (H7N9) virus; Respiratory syncytial virus; Human infection; Multiple reverse transcription polymerase chain reaction
引言

自2013年2月以来,发生在我国上海、安徽、江苏等省市的急性下呼吸道感染成为了公众的焦点,引起此次疫情的病原体为人感染高致病性H7N9型禽流感病毒(简称H7N9病毒),是一种重组的新型甲型流感病毒。禽类感染甲型H7流感病毒在全球范围内都有发生,但这是首次发现该病毒感染人类[ 1]。上海市黄浦区疾病预防控制中心(CDC)微生物实验室作为国家级流感监测网络实验室,在此次H7N9病毒防控工作中共收到137例监测病例标本。在检测H7N9病毒核酸的同时,我们同时还用多重逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)进行22种呼吸道病体原核酸的检测。通过检测,我们在1例重症肺炎患者H7N9病毒监测标本中检出了A型呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus A, RSV-A),并利用人胚肺成纤维细胞(MRC-5)对该标本进行了病毒分离,成功分离到了一株RSV-A。

材料和方法
一、对象

1.病例来源

上海某医院送检的H7N9禽流感监测病例标本,该病例患者为男性,9岁,临床症状:体温39.2 ℃,具有肺部影像学特征,并伴有咳嗽、肌肉酸痛等症状。

2.病例定义

人感染H7N9病毒监测病例需同时具备以下4项条件:(1)发热(腋下体温≥38 ℃以上);(2)具有肺炎的影像学特征;(3)发病早期白细胞总数降低或正常,或淋巴细胞分类计数减少;(4)不能从临床或实验室角度诊断为常见病原所致的肺炎[ 2]。

3.标本类型、采集、保存和运输

及时采集患者上呼吸道标本(鼻咽拭子、鼻腔抽取物、咽漱液和鼻洗液等)和下呼吸道标本(气管吸取物、肺洗液、痰液等)。拭子标本采集使用塑料杆的聚酯纤维拭子,采集后的标本保存于3 mL病毒采样液中,4 ℃保存,并使用生物安全转运装置2 h内将标本送至本实验室。

二、检测试剂与设备

病毒核酸纯化试剂为QIAGEN公司的QIAamp® Viral RNA mini kit,多重Real Time-PCR用荷兰PathoFinder公司生产的RespiFinder® SMART 22 FAST试剂盒;Real Time-PCR用RSV-A核酸检测试剂盒(荧光RT-PCR)购自北京金豪公司;细胞分离培养用Minimum Essential Medium (MEM)液、丙酮酸钠溶液、7.5%NaHCO3溶液、HEPES溶液、三抗溶液及胎牛血清(FBS)均购自美国GIBCO公司,上述试剂均在有效期内使用。用于分离病毒的人胚肺细胞(MRC-5)由中科院上海细胞库提供,工作细胞在30代以内使用。BAKE二级生物安全柜、QIAcube核酸纯化系统、罗氏480荧光定量PCR仪、ABI7300荧光定量PCR检测系统、二氧化碳培养箱及倒置显微镜等设备均运转正常。

三、方法

1.核酸抽提

取标本,融化后吸取140 μL置于QIAcube核酸纯化系统中,使用病毒核酸抽提程序进行病毒RNA的抽提,抽提后病毒RNA储存于100 μL RNase-free水中,4 ℃备检。

2.核酸检测

将纯化好的病毒核酸吸取10 μL,参照RespiFinder® SMART 22 FAST核酸检测试剂盒说明的要求,与15 μL反应混合液(内含反应液、逆转录酶和DNA聚合酶)充分混匀,置于罗氏480荧光定量PCR仪中进行扩增反应,扩增及检测程序严格按试剂盒说明书操作。

3.标本处理

将初筛结果为核酸阳性的标本分成3份,用抗菌药物处理,使青霉素G终浓度为200 U/mL、硫酸链霉素为200 μg/mL、两性霉素为0.5 μg/mL,4 ℃环境下处理4 h之后保存于-70 ℃。3份标本分别用作核酸检测、分离培养和留存备案。

4.分离培养

将阳性标本融化后吸取200 mL,接种于T25细胞瓶中状态良好、生长成单片的MRC-5细胞上,轻轻摇动,使标本液均匀地平铺于细胞面上,35 ℃吸附1 h。加入含2%FBS的MEM维持液6 mL,在35 ℃、5%CO2条件下培养至少7 d,每日观察细胞病变(CPE)。当CPE达到80%~100%时即收获,培养物保存于-70 ℃备检。对CPE阴性的培养物进行1~2代盲传,观察CPE。若未出现CPE,则弃去。进行病毒分离同时设有细胞对照。

5.毒株鉴定

将CPE阳性的培养物进行100倍稀释后,继续用MRC-5细胞进行传代2~3代,并观察CPE,同时用Real Time-PCR法对每次传代的培养物进行呼吸道合胞病毒的核酸检测。按照郭霍法则,若每次传代都产生相同的CPE,而核酸检测均为病毒核酸阳性,且分型结果也均相同,则判定为病毒分离成功。

结果
一、核酸检测结果

1份H7N9病毒监测标本在ROX、Tm 55 ℃出现了明显的阳性扩增峰,结果判定为检出RSV-A核酸。见图1:

图1 原始标本多重RT-PCR检测结果

二、病毒分离结果

对该RSV-A核酸阳性的标本进行病毒分离,在进行细胞接种后的7 d内未出现CPE,收获后进行盲传,在进行第1次盲传后48 h内出现了细胞圆缩,呈现葡萄串状并脱落的CPE,72 h后CPE达到了++++,见图2:

图2 原始标本分离结果

注:(a)MRC-5细胞对照;(b)RSV-A导致的MRC-5细胞病变

三、毒株鉴定

对CPE阳性的培养物稀释100倍后进行病毒的连续传代3次,均能出现相同的CPE,见图3:

图3 病毒传代结果

注:(a)传代24 h;(b)传代48 h

每次传代培养物均能检出RSV-A核酸。故判定此例标本中分离到的病毒为RSV-A。

讨论

呼吸道合胞病毒(RSV)是一种RNA病毒,属于副粘病毒科,有A、B 2种基因型。该病毒能引起组织细胞病变融合成为多核巨细胞,故而得名。RSV通过空气飞沫和密切接触传播,是常见的急性呼吸道感染病原体,多见于婴幼儿及儿童。在急性呼吸道感染婴幼儿的下呼吸道标本中有相当高的检出率[ 3]。RSV感染导致的临床症状与人感染H7N9禽流感有一定的相似性,都表现为发烧、咽痛、咳痰,严重者可引起下呼吸道症状如强烈的咳嗽、气急、气重,甚至引发重症肺炎[ 4, 5]。此株RSV-A是从1位9岁的重症肺炎患儿标本中分离得到,患儿入院时体温高达39.2 ℃,同时伴有咽痛、咳痰和呼吸困难,收治医院将其定义为人感染H7N9禽流感可疑病例进行了采样。本研究应用多重RT-PCR排除了H7N9病毒的感染,并通过病毒分离成功对该病例进行了确诊。

本研究采用的多重PCR能同时对22种呼吸道病原体核酸进行检测,有助于及时对临床病例,特别是对症状相似的急性呼吸道感染疾病进行快速诊断,也有助于疫情的早诊断、早治疗和早控制,可以最大限度降低疾病带来的风险,降低患者的医疗负担,在公共卫生突发事件的应急处置工作中有着广阔的应用前景[ 6, 7, 8]。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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