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王晨, 焦伟, 黎海澜, 叶璐夷, 朱自严. 中国壮族人群Lutheran缺失表型的EKLF/KLF1基因多态性研究 . 28(12): 1124-1127[WANG Chen, JIAO Wei, LI Hailan, YE Luyi, ZHU Ziyan. Research on the polymorphism ofEKLF/KLF1 gene in Lutheran deficient phenotype among Chinese Zhuang population . 上海检验医学, 28(12): 1124-1127]  
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中国壮族人群Lutheran缺失表型的EKLF/KLF1基因多态性研究
王晨1, 焦伟2, 黎海澜2, 叶璐夷1, 朱自严1
1.上海市血液中心,上海 200051
2.广西壮族自治区人民医院,广西 南宁 530021

王晨,男,1977年生,学士,助理研究员,主要研究方向为免疫血液学。

朱自严,联系电话:021-62700547。

基金:广西科学研究与技术开发计划课题(桂科攻0993003B-26); 卫生行业科研专项(201002005); 上海市公共卫生重点学科建设项目(12GWZX0201); 上海市卫生局科研课题资助(2010027);
摘要
目的

针对中国壮族人群中的Lu(a-b-)表型,检测其相关的EKLF/KLF1调控基因,以揭示其分子机理和遗传背景。

方法

对4 527名壮族人群中筛查出的22名Lu(b-)表型的先证者进行家系调查,血清学筛查家系中Lu(a-b-)个体,扩增其EKLF/KLF1调控基因的3个外显子,测序分析其遗传背景。

结果

在22个家系中包括先证者共检测出Lu(a-b-)表型57名。其中19个家系共51名个体的EKLF/KLF1基因中均发现同样的519-525dupCGGCGCC杂合突变;其余3个家系Lu(a-b-)表型的EKLF/KLF1基因中均发现895C>G杂合突变。

结论

中国壮族Lu(a-b-)血型的分子背景可能与EKLF/KLF1基因的特异性杂合突变密切相关,且绝大多数为519-525dupCGGCGCC的杂合突变类型。

关键词: 稀有血型; Lutheran血型; EKLF/KLF1基因
中图分类号:Q503 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2013)12-1124-04
Research on the polymorphism ofEKLF/KLF1 gene in Lutheran deficient phenotype among Chinese Zhuang population
WANG Chen1, JIAO Wei2, LI Hailan2, YE Luyi1, ZHU Ziyan1
1.ShanghaiBloodCenter,Shanghai 200051,China
2.ThePeople'sHospitalofGuangxiZhuangAutonomousRegion,GuangxiNanning 530021,China
Abstract
Objective

To reveal the molecule and genetic background ofEKLF/KLF1 gene in Lu(a-b-) phenotype among Chinese Zhuang population.

Methods

A total of 22 probands of Lu (b-) phenotype were detected among 4 527 Chinese Zhuang population donors. The Lu (a-b-) individuals of their family members were determined by serologic methods. In addition, 3 exons ofEKLF/KLF1 gene were amplified and sequenced. The genetic background was analyzed by sequencing.

Results

Among the 22 probands, 57 cases with Lu (a-b-) phenotype were determined. A total of 51 individuals from 19 pedigrees showedEKLF/KLF1 519-525dupCGGCGCC heterozygous mutation. The other 3 pedigrees' Lu (a-b-) phenotype hadEKLF/KLF1 (895C>G) heterozygous mutation.

Conclusions

The Lu (a-b-) in Chinese Zhuang population might be caused by specific heterozygous mutations inEKLF/KLF1 gene, especially theEKLF/KLF1 519-525dupCGGCGCC heterozygous mutation.

Keyword: Rare blood type; Lutheran blood type; EKLF/KLF1 gene
引言

Lutheran血型是人类血型系统中一个重要血型系统,一共包括19个抗原,其中Lua(LU1)和Lub(LU2)抗原由等位基因编码,Lu(a+)和Lu(b+)表型的频率分别为0.075和0.925。Lu(a-b-)是Lutheran血型系统的无效表现型,国外一些调查结果显示其频率为0.02%~0.05%[1],是一种很罕见的稀有血型。目前认为该血型的产生存在3种机制:LU基因存在导致其失活的突变;EKLF/KLF1基因杂合突变导致的抑制型个体。2008年Singleton等[2,3]提出,编码红细胞转录因子EKLF蛋白的 EKLF基因杂合突变,导致在红细胞中相关基因的转录水平普遍下降,造成稀有Lu(a-b-)表型;伴X型的Lu(a-b-),仅发现1例[3]。上述3种机制中,以 EKLF基因杂合突变导致的Lu(a-b-)表型最为多见,对50例Lu(a-b-)先证者家系的研究结果中有41例是该机制导致[1]。

壮族作为我国人口最多的一个少数民族,其稀有血型的分布和频率以及产生的分子遗传背景,与国外可能有很大的不同。我们通过对4 527名壮族人群中筛查出的22名Lu(b-)表型的先证者进行家系调查,针对性地检测其中Lu(a-b-)血型个体的 EKLF基因,研究壮族人群Lu(a-b-)血型的相关分子及遗传背景。

材料和方法
一、对象

选择壮族人群占当地人口95%以上的壮族聚居地,同时满足三代中未与外族通婚的无亲缘关系的个体为研究对象。通过前期的筛选实验[4],对其中22名Lu(b-)的壮族先证者进行家系调查,采集包括先证者在内的外周静脉血样共120名。将乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝的外周血标本取其中5 μL压积红细胞在0.9%生理盐水中配制成2%浓度的悬浮液,供血清学检测使用,其余血样供抽提基因组DNA使用。

二、方法

1. Lu(a-b-)血型的血清学检测

(1)试剂:鼠源性单克隆抗-Lub(BRIC108)由国际血型参比实验室(IBGRL)惠赠,抗-Lua和抗-Lub多克隆抗体购自荷兰Sanquin公司;(2)Lu(a-b-)血型的筛选和确认:调整鼠源性单克隆抗-Lub,使其浓度为2 μg/mL。用U型96孔微量板抗球蛋白方法进行筛选,方法见参考文献[5];初筛为Lu(b-)的标本,分别用抗-Lua和抗-Lub多克隆抗体,通过间接抗球蛋白试管法进行确认,方法见参考文献[6]。

2. Lu(a-b-)个体的 EKLF基因分析

(1)基因组DNA抽提:对家系中血清学检测为Lu(a-b-)表型以及Lu(b+)表型的对照个体,使用天根全血DNA抽提试剂盒从全血中抽提基因组DNA,方法见抽提试剂盒说明书;(2) EKLF基因外显子扩增:对血清学检测为Lu(a-b-)表型的个体,针对其 EKLF基因的3个外显子进行扩增。其引物序列参考文献[2],委托上海生工公司合成,聚合酶链反应(PCR)反应体系为50 μL,含基因组DNA 1 μL,10×PCR buffer 5 μL,5 μmol/L dNTP 2 μL,10 μmol/L引物各1 μL,MgCl2 1.5 μL,Takara HS Taq DNA聚合酶0.5 μ,10×PCR Enhancer 10 μL(扩增第2外显子时为5 μL );使用Perkin-Elmer GeneAmp 9700 PCR仪(美国ABI公司)进行扩增,程序参见文献[2];(3)测序:将PCR扩增产物纯化后委托上海生工公司进行测序或TA克隆测序,测序结果用Gene Runner和Chromas软件与Genbank参考序列进行对比分析。

结果
一、血清学结果

在采集的壮族先证者及其家系共120名标本中检测出57名Lu(a-b-)表型的个体。

二、 EKLF基因分析

将测序结果与Genbank中 EKLF基因参考序列(NM_006563.3)对比后,在上述Lu(a-b-)个体中有19个家系共51名Lu(a-b-)个体的 EKLF基因均发现了同样的杂合突变:第2外显子出现7个碱基519-525dupCGGCGCC的插入,导致阅读框架发生位移,自176位往后氨基酸序列(Gly176ArgfsX179)发生改变并提前形成了终止密码子。见图1:

图1 EKLF等位基因

注:(a)TA克隆中1条 EKLF等位基因序列;(b)另1条 EKLF等位基因发生括号内519-525dupCGGCGCC突变

家系调查结果见图2:

图2 EKLF基因第2外显子519-525dupCGGCGCC突变家系之一

有3个家系共6名Lu(a-b-)个体的 EKLF基因发现第2外显子895C>G的单一碱基杂合突变,造成氨基酸序列His299Asp的突变。见图3:

图3 EKLF基因第2外显子

注:(a) EKLF基因第2外显子正常序列;(b) EKLF基因第2外显子895C>G杂合突变

家系调查结果见图4:

图4 EKLF基因第2外显子895C>G杂合突变家系之一

正常表达Lutheran抗原的Lu(b+)对照标本中没有1名发现上述Gly176ArgfsX179或His299Asp突变。同时,一些对照标本和Lu(a-b-)标本发现有304T>C (Ser102Pro) 突变,仅1个家系中对照标本和Lu(a-b-)标本发现有325C>T (Pro109Ser) 突变。家系调查结果见图5、6:

图5 EKLF基因304T>C突变家系之一

注:*为Lu(a-b-)表型,?为未采集到标本

图6 EKLF基因325C>T突变家系

注:*为Lu(a-b-)表型

讨论

本研究对我国壮族人群中22名初筛为Lu(b-)的壮族先证者家系进行调查,包括先证者在内,一共检出57名壮族Lu(a-b-)血型个体。数据显示,Lu(a-b-)血型在中国台湾地区的频率约0.05%[1],上海地区的频率约0.02%[7],而广西壮族地区的频率约1.26%[4],显著高于台湾和上海地区。

本研究发现有19个家系共51名Lu(a-b-)标本在 EKLF基因第2外显子中均出现了同样的杂合突变519-525dupCGGCGCC (Gly176ArgfsX179), 导致了阅读框架发生位移,影响N末端转录激活区域(氨基酸1-275),并提前形成终止密码子。本研究显示壮族Lu(a-b-)血型中绝大多数突变为Gly176ArgfsX179,对家系调查的结果证实其遗传背景(图2)。并且,Gallienne等[8]报道韩国人和越南人中也发现该突变,提示其可能为亚洲人群所特有的导致Lu(a-b-)血型的 EKLF基因突变。

在其余3个家系共6例Lu(a-b-)标本中发现了一种新的突变类型: EKLF基因第2外显子895C>G(His299Asp)杂合突变,导致锌指结构域1的单一氨基酸改变,可能影响正常的DNA结合模式。家系调查结果也证实上述突变与壮族Lu(a-b-)血型的遗传相关(图4)。

Singleton等[2,9]研究证实,编码红细胞转录因子EKLF蛋白的 EKLF基因出现Pro190LeufsX47、Arg319GlufsX34的杂合移码突变,以及锌指结构中由单一碱基的杂合突变导致His299Tyr、Arg328Leu、Arg328His、Arg331Gly的氨基酸改变,均导致其中1条 EKLF基因的功能丧失,而仅靠单一的正常等位基因的转录会导致EKLF蛋白水平很低,随之而来的是在红细胞中基因的转录水平的普遍下降,从而产生稀有的Lu(a-b-)血型。根据实验结果推测本研究发现 EKLF基因的2种杂合突变均为杂合移码突变及锌指结构的单一碱基杂合突变,与Singleton等研究结果类似,其在EKLF蛋白结构中的位置见图7:

图7 EKLF基因突变在EKLF蛋白结构中位置

注:黑色区域为编码区

家系调查的结果也证实, EKLF基因的Gly176ArgfsX179和His299Asp突变,与壮族的Lu(a-b-)血型密切相关。

本研究也发现在Lu(a-b-)标本以及正常表达Lutheran血型抗原的对照标本中,也有一些出现 EKLF基因Ser102Pro或Pro109Ser的突变。根据家系调查结果,Ser102Pro与Pro109Ser突变与Lu(a-b-)表型不存在遗传相关性(图5、图6)。因此, EKLF基因的突变可能是多样性的,但是可导致Lu(a-b-)表型的突变只是少数特异性的突变。

综上所述,对22名中国壮族人群Lu(a-b-)血型家系的研究表明,包含先证者在内的所有57名Lu(a-b-)血型的产生,其分子背景可能与EKLF基因存在特异性的杂合突变密切相关。这对于研究我国少数民族的稀有血型,建立中国稀有血型数据库,以便更好地服务临床输配血工作提供了宝贵的实验基础。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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